七厘散促小鼠觸須部創(chuàng)面修復(fù)及部分機(jī)制探討＊

劉愛(ài)軍 易 華 杜標(biāo)炎 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，日常生活中極易發(fā)生創(chuàng)傷。中醫(yī)中藥治療皮膚損傷歷史悠久，療效確切。七厘散（Qili San）是著名的傷科要藥，至今仍在臨床廣為應(yīng)用，但是由于中藥中成分復(fù)雜，其促進(jìn)皮膚愈合的機(jī)制目前尚未完全明了，本文主要研究七厘散在小鼠觸須部皮膚缺損修復(fù)中的作用，并初步探討了七厘散含藥血清對(duì)皮膚成纖維的促增殖作用，為進(jìn)一步研究七厘散促進(jìn)皮膚干細(xì)胞的增殖和分化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠，出生后約4w，質(zhì)量20～25g，購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK（粵）2008－0020）。

1.2 主要試劑 七厘散購(gòu)自北京同仁堂制藥廠，批號(hào)：0100006；無(wú)菌生理鹽水、醫(yī)用酒精、無(wú)菌棉簽均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)保健科；外用噴劑金因肽購(gòu)自廣州紅十字會(huì)醫(yī)院，產(chǎn)品批號(hào)：2009－08－08，含表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）2000IU／mL；梯度酒精、二甲苯、HE染料、中性樹(shù)膠均為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院技術(shù)室提供。高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?5cm2塑料培養(yǎng)瓶（Coning公司）；胰蛋白酶（Sigma公司），余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 德國(guó)TP1020組織脫水機(jī)；德國(guó)EG1160石蠟包埋機(jī)；德國(guó)LeicaRM2135輪轉(zhuǎn)切片機(jī)；德國(guó)HI1220攤片機(jī)；德國(guó)ET4040染色機(jī)；防脫玻片及蓋玻片購(gòu)自博士德生物試劑公司；日本OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 七厘散促小鼠觸須部皮膚修復(fù)的作用：無(wú)菌條件下剪去昆明雄小鼠雙側(cè)觸須部表皮，保留真皮，隨機(jī)分為5組，每組20只，分別進(jìn)行以下處理：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組創(chuàng)面涂以生理鹽水；陽(yáng)性藥物對(duì)照組以金因肽均勻噴濕創(chuàng)面，約4000IU／mL×10cm2；七厘散內(nèi)服組以120mg／mL七厘散混懸液、按0.2mL／10g灌胃，七厘散外用組以20%龍血竭混懸液、按24mg／cm2涂于觸須部創(chuàng)面；七厘散內(nèi)服＋外用組以上述內(nèi)服、外用劑量同時(shí)應(yīng)用，以上各組每日定時(shí)處理1次，連續(xù)觀察各組動(dòng)物7d創(chuàng)面愈合情況。術(shù)后1d、3d、5d、7d取觸須創(chuàng)面，每組每次5只小鼠，行常規(guī)病理學(xué)組織切片，HE染色，片厚2μm，顯微鏡下觀察各組標(biāo)本改變。

1.4.2 七厘散含藥血清的制備：雄性昆明小鼠，質(zhì)量20～25g，七厘散劑量為等效劑量的20倍，無(wú)菌生理鹽水混勻，每天灌胃2次，間隔12h，連續(xù)7d，第8日禁食不禁水，上午灌胃2次，間隔2h，于末次灌胃后1h斷頭取血，所取全血室溫下靜置2～3h，3000r／min離心10min，分離血清，將所有血清混合；56℃、30min滅活；0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌；－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)：孕齡12.5d～14.5d昆明小鼠處死后，無(wú)菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭、四肢和內(nèi)臟，剪碎軀干部分組織，加入2.5g／L胰蛋白酶消化1min，用含血清的培養(yǎng)基中止消化，離心，棄上清，用培養(yǎng)基重新懸浮組織，將組織接種入25cm2培養(yǎng)瓶，5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)，4～6d原代細(xì)胞長(zhǎng)滿，常規(guī)消化傳代，調(diào)整P3代細(xì)胞濃度，以8000個(gè)／孔接種于96孔板，細(xì)胞饑餓24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 MTT法檢測(cè)七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響：高糖DMEM含總血清20%，其中含七厘散含藥血清分別為0%、2.5%、5%、10%、20%五個(gè)濃度梯度，余血清以胎牛血清補(bǔ)足血清總體積為20%，用作用于96孔板中培養(yǎng)的胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞，24h后MTT法檢測(cè)不同條件下胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，無(wú)血清DMEM作為空白對(duì)照，尋找能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的七厘散含藥血清體積百分比。

2 結(jié) 果 2.1 各組動(dòng)物創(chuàng)面大體觀察 術(shù)后1d，七厘散內(nèi)服＋外用組各組動(dòng)物創(chuàng)面無(wú)出血，呈暗紅色，約有一半出現(xiàn)結(jié)痂，其余各組動(dòng)物創(chuàng)面無(wú)出血，呈暗紅色，無(wú)結(jié)痂。術(shù)后2d，陽(yáng)性藥物對(duì)照組、七厘散內(nèi)服＋外用組已全部結(jié)痂；其余各組亦出現(xiàn)結(jié)痂。術(shù)后3d，除實(shí)驗(yàn)對(duì)照組外其余各組動(dòng)物創(chuàng)面全部結(jié)痂。術(shù)后5d，陽(yáng)性藥物對(duì)照組、七厘散內(nèi)服＋外用組已出現(xiàn)痂皮脫落，新生表皮平滑、有光澤、色淡。術(shù)后6d，其余各組開(kāi)始痂皮脫落。術(shù)后7d，各組小鼠觸須部創(chuàng)面基本痊愈。

2.2 各組動(dòng)物創(chuàng)面病理學(xué)改變 術(shù)后1d，各組鏡下可見(jiàn)大量滲出紅細(xì)胞、炎細(xì)胞（圖1），七厘散內(nèi)服＋外用組紅細(xì)胞滲出少，炎性反應(yīng)較輕（圖2）。術(shù)后3d，各組動(dòng)物創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均減少（圖3）；七厘散內(nèi)服＋外用組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組創(chuàng)面可見(jiàn)有表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生（圖4）。術(shù)后5d，各組可見(jiàn)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生，表皮細(xì)胞和膠原纖維排列疏松紊亂（圖5），七厘散內(nèi)服＋外用組成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原纖維合成和分泌增加，真皮層較致密，新生表皮較厚，細(xì)胞分層明顯（圖6）。術(shù)后7d，創(chuàng)面基本修復(fù)，七厘散內(nèi)服＋外用組表皮細(xì)胞分層明顯，真皮致密，表皮－真皮連接緊密（圖7），其余各組表皮－真皮連接有局部不牢固（圖8）。

圖1 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后1d，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，滲出紅細(xì)胞較多HE染色 ×400

圖2 七厘散內(nèi)服＋外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后1d，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，滲出紅細(xì)胞少 HE染色 ×400

圖3 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后3d，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少HE染色 ×400

圖4 七厘散內(nèi)服＋外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后3d，創(chuàng)面表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞開(kāi)始增生 HE染色 ×400

圖5 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后5d，表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維排列疏松紊亂 HE染色 ×400

圖6 七厘散內(nèi)服＋外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后5d，新生表皮明顯，成纖維細(xì)胞、膠原纖維增多 HE染色 ×400

圖7 七厘散內(nèi)服＋外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后7d，新生表皮明顯，真皮致密，表皮－真皮連接緊密 HE染色 ×400

圖8 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后7d，新生表皮－真皮局部連接欠佳 HE染色× 400

2.3 MTT測(cè)定七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

圖9 七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響104個(gè)／孔

討 論 皮膚位于身體表面，直接與外界環(huán)境相接觸，皮膚創(chuàng)傷是臨床上的常見(jiàn)病與多發(fā)病，如何快速有效地促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合、防止各種嚴(yán)重并發(fā)癥有著重要的臨床意義。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面形成血瘀證［1］，治療上遵循“活血化瘀”、“祛瘀生肌”、“偎膿長(zhǎng)肉”等治則，療效確切，使用方便，毒副作用?。?］。七厘散出自《良方集腋》，七厘散又名“傷科七厘散”、“神效七厘散”、“臺(tái)麝七厘散”，是著名的傷科常用中成藥。

本研究結(jié)果提示，七厘散對(duì)小鼠觸須部皮膚創(chuàng)面有抗炎作用，并促進(jìn)痂皮形成，痂皮的形成時(shí)間較傷科常用龍血竭提早約1d［3］，痂皮形成對(duì)創(chuàng)面早期愈合具有積極地意義，阻止外界微生物入侵，防止機(jī)體水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失，能防止機(jī)械刺激對(duì)創(chuàng)面造成二次損害。七厘散為經(jīng)典傷科復(fù)方，其組成為：血竭、乳香、沒(méi)藥、朱砂、冰片、當(dāng)歸、紅花、麝香、兒茶。方中血竭、紅花、當(dāng)歸活血祛瘀、生肌，乳香、沒(méi)藥行氣散血、消腫止痛，冰片清熱生肌止痛，兒茶清熱定痛生肌、斂創(chuàng)止血，其抗炎生肌的效果優(yōu)于單味藥龍血竭。金因肽的有效成分為EGF，EGF雖亦能促進(jìn)成纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞增殖，但EGF在體內(nèi)的半衰期極短，無(wú)法保持長(zhǎng)期有效濃度。同時(shí)，我們還證實(shí)七厘散含藥血清能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的增殖。成纖維細(xì)胞在皮膚愈合中具有重要作用，其能合成和分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分并參與形組成肉芽組織，肉芽組織不僅能填充皮膚缺損，亦能促進(jìn)表皮細(xì)胞沿著創(chuàng)面周緣向中央遷移；成纖維細(xì)胞分泌的bFGF、VEGF、EGF等細(xì)胞因子又能促進(jìn)創(chuàng)面各種細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合［4，5］。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究七厘散促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖的有效成分及其促進(jìn)的分子機(jī)制奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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