蛻皮素對(duì)大鼠肺血管通透性影響的實(shí)驗(yàn)研究

陳 江 池達(dá)智 林昭偉 黃東平 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院急診科（地址102820）

蛻皮甾酮（Ecdysterone，EDS）即β蛻皮激素，是具最強(qiáng)生理活性的蛻皮激素，研究表明EDS能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、調(diào)節(jié)免疫3。本實(shí)驗(yàn)旨在從肺水腫及肺血管通透性的角度探索EDS是否能減輕肺損傷。

1 材料和方法 1.1 材料和試劑 LPS購自sigma公司，蛻皮甾酮由中國科學(xué)院昆明植物研究所提供，其余試劑均為南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心提供。

1.2 大鼠急性肺損傷模型及分組 雄性 Wstar大鼠64只，體重200±20g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷組、地塞米松干預(yù)組和EDS干預(yù)組，每組8只。①正常對(duì)照組（N組）：大鼠尾靜脈注射生理鹽水。②損傷組（C組）：大鼠尾靜脈注射LPS（5mg／kg）。③地塞米松干預(yù)組：注射LPS的同時(shí)注射地塞米松（5mg／kg）④EDS干預(yù)組：注射LPS的同時(shí)注射EDS（15mg／kg）；另外每組各取8只大鼠于注射LPS（對(duì)照組于注射生理鹽水）前1min尾靜脈注射伊文思藍(lán)50mg／kg。

1.3 肺系數(shù)、肺水含量及肺通透指數(shù)測定 注射后6h腹主動(dòng)脈抽動(dòng)脈血后處死動(dòng)物，取全肺，計(jì)算肺系數(shù)（Lungindex）［全肺重（g）／體重（g）］。取左肺上葉測定肺水含量（Lungwater）［肺濕重－肺干重］×100／肺濕重］。取右肺下葉行支氣管肺泡灌洗，用Lowry法測定支氣管灌洗液（bronchoalveolar，BALF）和血漿的蛋白含量，計(jì)算肺通透指數(shù)（Lung permeability index，LPI）［BLAF蛋白含量／血漿蛋白含量］。

1.4 肺血管通透性變化 根據(jù)Standiford11方法改進(jìn)，先描繪evans藍(lán)的甲酰胺溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組注射Evans藍(lán)（50mg／kg）動(dòng)物在注射染料6h后開胸取肺組織300mg，浸泡在4mL甲酰胺分析純液中，置45～500C溫箱中溫育72h，待組織中色素與浸泡液中色素達(dá)到平衡，取出組織，離心，取上清液，用752型分光光度計(jì)λ620nm進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每克肺組織中Evans藍(lán)含量，以反映肺血管通透性變化。

1.5 血?dú)夥治?取各組未經(jīng)伊文思藍(lán)注射的8只大鼠，腹主動(dòng)脈抽血，所抽動(dòng)脈血送動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

1.6 病理形態(tài)學(xué)計(jì)分方法［10］將左肺上葉用10%福爾馬林固定，常規(guī)石臘包埋切片，HE染色，觀察肺組織病理改變，并根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎細(xì)胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成、肺不張改變，按程度“無、輕、中、重”分別計(jì)“0、1、2、3”，累計(jì)總分，予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用方差分析（One－way Anova），比較組間差異。

2 結(jié) 果 2.1 肺系數(shù)、肺水含量、肺通透指數(shù)變化結(jié)果表明，地塞米松組的肺系數(shù)、肺水含量、肺通透指數(shù)均顯著低于損傷組，但高于正常組，EDS組的肺系數(shù)、肺水含量、肺通透指數(shù)與地塞米松組相比無顯著性差異。

表1 EDS對(duì)大鼠肺水腫參數(shù)的影響（n＝8，±s）

表1 EDS對(duì)大鼠肺水腫參數(shù)的影響（n＝8，±s）

與生理鹽水對(duì)照組比較，▲P＜0.01，與LPS損傷組比較，ΔP＜0.01。

group Lung index（×10）Lung water（%）LPI（×10－1）Normal 0.31±0.022 74.01±6.48 6.84±0.486 LPS 0.67±0.049▲ 79.62±5.39▲ 13.84±0.846▲LPS＋Dex 0.52±0.039▲Δ 77.92±4.82▲Δ 10.28±0.995▲Δ LPS＋EDS20 0.52±0.029▲Δ 78.50±3.92▲Δ 10.37±0.538▲Δ

2.2 肺血管通透性變化 2.2.1evans藍(lán)－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)evans藍(lán)含量與吸光度，回歸方程y＝3.2284x－0.0792，（y：evans藍(lán) mg／100mL，x：吸光度，r2＝0.9944，P＝0.00）（圖1）

圖1 伊文思藍(lán)含量－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 各組肺血管通透性比較：根據(jù)回歸方程，換算出單位組織中evans藍(lán)含量（mg），以表示血管通透性大小。結(jié)果如表2所示，在傷后6h，地塞米松組的肺血管通透性顯著低于損傷組，但高于正常組，EDS組的肺血管通透性與地塞米松組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 肺組織的病理學(xué)變化（見插圖）肺大體觀察，鹽水對(duì)照組外觀基本無明顯異常變化；損傷組肺體積增大，包膜下有點(diǎn)、片狀出血；地塞米松干預(yù)組較內(nèi)毒素組明顯減輕，EDS干預(yù)組則與地塞米松干預(yù)組類似。光鏡下觀察，鹽水對(duì)照組基本正常；內(nèi)毒素組肺泡壁破壞嚴(yán)重，肺間質(zhì)、肺泡水腫，肺泡隔明顯增寬，大部分肺泡萎陷，肺泡及肺間質(zhì)有較多中性粒細(xì)胞浸潤，部分肺泡可見出血；地塞米松干預(yù)組及EDS組肺組織中上述改變明顯減輕。病理計(jì)分

圖2 各組病理評(píng)分比較

表2 每克肺組織含evans藍(lán)量（n＝8，±s）

表2 每克肺組織含evans藍(lán)量（n＝8，±s）

group Evans blue（mg／g）Normal 0.8628±0.0215 LPS 0.9845±0.0403▲LPS＋Dexamethasone 0.9315±0.0399▲Δ LPS＋EDS20mg／kg 0.9413±0.0294▲Δ

與生理鹽水對(duì)照組比較，▲P＜0.01，與LPS損傷組比較，ΔP＜0.01。

3 血?dú)庵笜?biāo)的變化 與 NS組相比，LPS組PaO2、PH值明顯下降，PaCO2明顯升高。地塞米松和EDS預(yù)處理組與LPS組相比PaO2、PH值明顯升高，PaCO2明顯降低。

表3 大鼠血?dú)庵笜?biāo)的變化（n＝8，±s）

表3 大鼠血?dú)庵笜?biāo)的變化（n＝8，±s）

Group PaO2（kPa） PaCO2（kPa） PH NS 14.60 ±0.63 4.03±0.72 7.41±0.04 LPS 9.67±0.77▲ 6.09±0.54▲ 7.29±0.06▲LPS＋DX 13.68±0.74▲Δ 5.01±0.54▲Δ 7.35±0.04▲Δ LPS＋EDS 13.31±0.68▲Δ 4.95±0.49▲Δ 7.34±0.03▲Δ

與生理鹽水對(duì)照組比較，▲P＜0.01，與LPS損傷組比較，ΔP＜0.01。

討 論 肺部感染可導(dǎo)致急性肺損傷（ALI）或更嚴(yán)重并發(fā)癥急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發(fā)生，是人類的首要死亡原因［1，2］。ALI的主要特征是微血管通透性增高，中性粒細(xì)胞聚集和促炎性介質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致的嚴(yán)重肺損傷。革蘭氏陰性細(xì)菌感染可以使人體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生過度反應(yīng)導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生［4，5］。膿毒血癥的一個(gè)重要臨床特征是肺炎導(dǎo)致的急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），表現(xiàn)為難以控制的肺部對(duì)脂多糖的的炎性應(yīng)答反應(yīng)［6］。盡管近來在這一領(lǐng)域的研究出現(xiàn)了很多的進(jìn)展，但統(tǒng)計(jì)學(xué)表明急性肺損傷所導(dǎo)致的死亡率仍然居高不下，需要尋找新的治療方法和藥物［2］。

圖1－1 正常對(duì)照組肺組織切片圖（HE×100）

圖2－1 LPS損傷組肺組織切片圖（HE×100）

圖1－2 正常對(duì)照組肺組織切片圖（HE×400）

圖2－2 LPS損傷組肺組織切片圖（HE×400）

圖3－1 地塞米松干預(yù)組肺組織切片（HE×100）

圖4－1 蛻皮激素干預(yù)組肺組織切片 （HE×100)

圖3－2 地塞米松干預(yù)組組肺組織切片（HE×400）

圖4－2 蛻皮激素干預(yù)組組肺組織切片（HE×400）

地塞米松為腎上腺皮質(zhì)激素，作用廣泛，可作用于ALI的多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)，廣泛應(yīng)用于臨床ALI的治療，但由于地塞米松有增加感染的發(fā)生率、延遲傷口愈合、骨質(zhì)疏松等副作用，所以其應(yīng)用仍然存在爭議［7］。因此尋找一種副作用較小的替代藥物是必要的。

EDS屬于昆蟲生長代謝調(diào)節(jié)激素，最早為昆蟲學(xué)家所研究，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EDS對(duì)于高等動(dòng)物同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性，其主要作用有：促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)糖和脂類代謝，免疫調(diào)節(jié)，減輕肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善微循環(huán)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等作用［8，9］，可用于肺損傷的治療。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EDS能減輕肺水腫，降低肺系數(shù)和肺含水量，減輕內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，降低肺血管通透性，其具體的作用機(jī)制尚不清楚，可能在于EDS具有促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的特性，以及阻斷LPS與其受體的結(jié)合。因此，從EDS能夠減輕肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及阻斷LPS與其受體結(jié)合兩方面，可以認(rèn)為EDS對(duì)于膿毒血癥所致的ALI有治療作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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