趙永強(qiáng)，雋兆東，管英俊，劉寶堂，王永明

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心胸外科，山東 濰坊261031；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；3.濰坊市第二人民醫(yī)院 胸外科）

曹澤玲等［1］研究表明吡格列酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。王浩等［2］研究顯示吡格列酮通過上調(diào)磷酸化ERK1／2表達(dá)，從而對(duì)大鼠心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。我們的前期研究也表明吡格列酮通過激活Ras／PI3K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡作用。但兩信號(hào)通路之間是否有聯(lián)系以及如何聯(lián)系國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究采用培養(yǎng)Wistar大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型，觀察PI3K與ERK1／2信號(hào)通路在吡格列酮介導(dǎo)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一日齡Wistar大鼠乳鼠20只（Wistar大鼠由山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

吡格列酮（朵英），DMEM培養(yǎng)基、0.1%胰蛋白酶液（Solarbio），bs－2637R、bs－3016R免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京博奧森），小鼠抗橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、蛋白抽提試劑盒、ECL發(fā)光液（北京中杉金橋）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 按王強(qiáng)等［3］原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，依實(shí)驗(yàn)室條件加以改進(jìn)。1－2日齡 Wistar大鼠乳鼠無菌條件下開胸取出心臟，剪取心室肌，剪碎至1mm3左右，0.1%的胰蛋白酶液振蕩水浴（37℃）消化10min，沉淀取上清，按1∶1比例加含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，以1 000r／m的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，DMEM重懸 ，重復(fù)至消化完全。收集重懸液，差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至（0.5%－1）×106／ml，接種至培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，兩天后換液。

1.3.2 分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)分為四組：每組5只，大鼠乳鼠取出心臟按上述方法培養(yǎng)出心肌細(xì)胞，正常組（Co組）、缺血再灌注組（Ⅰ組）、Ⅰ組＋吡格列酮預(yù)處理組（Pi組）、Pi組＋PI3K 抑制劑LY294002組（Pi＋LY組）。四組培養(yǎng)至第4日以后，換無血清低糖DMEM培養(yǎng)過夜。將無血清低糖DMEM培養(yǎng)基置三氣培養(yǎng)箱（37℃，95%N2，5%CO2）無氧預(yù)處理30min。棄去原有培養(yǎng)基，加入2 ml預(yù)處理培養(yǎng)基，并按分組加入以下試劑：①Ⅰ組：2μl DMSO。②Pi：2μl吡格列酮使用液。③Pi＋LY組：2μl吡格列酮使用液＋2μl LY294002使用液。三組置三氣培養(yǎng)箱（37℃，95%N2，5%CO2）缺氧處理3h，然后換含血清高糖DMEM轉(zhuǎn)到常氧條件（37℃、5%CO2）復(fù)氧處理3h。Co組：2ml含血清高糖DMEM＋2μl DMSO在常氧條件下培養(yǎng)。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ERK1／2、p－ERK1／2細(xì)胞爬片長(zhǎng)滿80%左右時(shí)室溫下冷丙酮固定20 min，PBS洗滌三次，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，37℃山羊血清封閉孵育后，分別滴加ERK1／2、p－ERK1／2抗體（1∶200），濕盒中4℃冰箱過夜，加入過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶500），DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)，脫水透明封片，共聚焦顯微鏡下拍照，Image－pro plus 6.0軟件分析得出 OD值。

1.3.4 Western－blotting定量檢測(cè)p－ERK 1／2 細(xì)胞經(jīng)洗滌后加入細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)移至離心管，超聲破碎。4℃、12 000轉(zhuǎn)／min離心15min，取上清。取部分樣品酶標(biāo)儀BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品中加入5×上樣緩沖液，取90μg蛋白用12%SDSPAGE進(jìn)行電泳。90V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜（NC膜），轉(zhuǎn)膜時(shí)間90min。室溫下將NC膜用5%脫脂奶粉／0.01mol／L PBS封閉1h。加適當(dāng)比例稀釋的p－ERK1／2抗體，4℃冰箱孵育過夜。5%脫脂奶粉／0.01mol／L PBS漂洗3次／10min。加通用二抗，室溫孵育2h。0.01mol／L PBS漂洗3次／10min。將化學(xué)發(fā)光劑ECL的增強(qiáng)液和穩(wěn)定的過氧化物酶溶液1∶1比例混合后滴加到NC膜上，室溫反應(yīng)2min。暗室中感光及UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。Quantity One軟件分析條帶，得出光密度OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組間用單因素方差分析（ANOVA），各組之間的兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) ERK1／2（圖1）與p－ERK1／2表達(dá)（圖2）

ERK1／2在各組中的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）；Pi組p－ERK1／2表達(dá)明顯高于Ⅰ組與 Pi＋LY組（0.1199±0.0211vs0.0827±0.0089，0.1199±0.0211vs 0.0920±0.0110，P＜0.05），Ⅰ組p－ERK1／2表達(dá)也明顯高于 Co組（0.0827±0.0089 vs 0.0669±0.0115，P＜0.05）。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法示ERK1／2（×200）在四組心肌細(xì)胞中的陽性表達(dá)

2.2 p－ERK1／2蛋白水平的表達(dá)變化（圖3）

Western blotting結(jié)果顯示，與Ⅰ組與Pi＋LY組相比，Pi組明顯升高（0.8858±0.0474vs0.4906±0.0106，0.8858±0.0474vs0.5630±0.0245，P＜0.05），Ⅰ組表達(dá)明顯高于 Co組（0.4906±0.0106 vs0.2707±0.0202，P＜0.05）。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法示p－ERK1／2（×200）在四組心肌細(xì)胞中的陽性表達(dá)

圖3 四組內(nèi)p－ERK1／2在蛋白水平的表達(dá)變化

3 討論

近年來，隨著溶栓療法、動(dòng)脈搭橋術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)等方法的建立和推廣，使心臟重新獲得血液供應(yīng)，明顯減輕了細(xì)胞損傷，提高了臨床療效。但是，恢復(fù)血液再灌注后，患者細(xì)胞功能代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞反而加重，因而將這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury）。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一，主要與活性氧生成、鈣超載、中性粒細(xì)胞激活、線粒體損傷等有關(guān)［4］。

Hausenloy DJ 等［5］把 PI3K－AKT、ERK1／2、JNK MAPK等信號(hào)途徑在缺血再灌注損傷中的激活稱為促生存激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或再灌注損傷救援激酶途徑。已經(jīng)證明激活上述再灌注損傷救援激酶可能減輕再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡。1999年，Matsui T等［6］發(fā)現(xiàn)在某些條件下激活PI3K／Akt信號(hào)通路可有效抑制低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生，具有心血管保護(hù)作用的因子，如胰島素［6］、促紅細(xì)胞生成素［7］、刺五加［8］、瑞舒伐他汀［9］等均是通過激活PI3K／Akt通路抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮心血管保護(hù)作用。我們的前期研究表明與缺血再灌注損傷比較，吡格列酮組凋亡指數(shù)降低，磷酸化AKT表達(dá)明顯增加，但這種變化被PI3K特異性抑制劑LY294002抑制；吡格列酮通過激活Ras／PI3K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡作用。同樣王浩等［2］對(duì)吡格列酮通過ERK1／2信號(hào)通路抑制大鼠心肌缺血再灌注對(duì)心肌的損傷也進(jìn)行了比較透徹的研究，研究顯示缺血再灌注后，大鼠心肌磷酸化ERK1／2表達(dá)上調(diào)，吡格列酮上調(diào)磷酸化ERK1／2表達(dá)，從而對(duì)大鼠心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

PI3K和ERK1／2信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，都調(diào)節(jié)著細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及一些細(xì)胞內(nèi)重要基因的表達(dá)。吡格列酮分別通過這兩條通路對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的研究比較多，但兩者在吡格列酮產(chǎn)生保護(hù)作用中的影響研究甚少。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：Pi組p－ERK1／2的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ組，而這種表達(dá)被PI3K特異性抑制劑LY294002抑制，這說明在吡格列酮保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷中還存在PI3K／ERK1／2信號(hào)傳導(dǎo)通路。這為以后臨床用藥減輕心肌缺血再灌注對(duì)心肌的損傷提供了新的靶點(diǎn)。

［1］曹澤玲，葉 平，龍超良，等.吡格列酮對(duì)大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中華臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（10）：1112.

［2］王 浩.PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究［D］.北京：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2008.

［3］王 強(qiáng)，王東進(jìn)，朱凌云，等.改良的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（6）：1168.

［4］李 凱，鄭世營(yíng).心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（1）：6.

［5］Hausenloy DJ，Yellon DM.New directions for protecting the heart against ischemia－reperfusion injury：targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase（RISK）pathway［J］.Cardiovasc Res，2004，61（3）：448.

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