李海煒，秦 雪＊，李 山，王 健，賴戰(zhàn)峰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)部，廣西 南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系）

電泳法分析血清或尿液中蛋白質(zhì)，輔助臨床診斷的重要性已被廣泛認(rèn)可。隨著電泳技術(shù)和儀器的發(fā)展，毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE）逐漸受到重視。CE技術(shù)是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的分離分析技術(shù)，近年來該技術(shù)在科研和臨床領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1，2］。

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種骨髓漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，特點(diǎn)是骨髓中異常漿細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）大量增殖，合成和分泌大量結(jié)構(gòu)均一的單克隆免疫球蛋白（M蛋白）或（和）其輕鏈，引起骨痛及病理性骨折、貧血、出血、感染、腎功能損害、高鈣血癥和免疫球蛋白異常等臨床表現(xiàn)。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，易誤診或漏診，常規(guī)化療完全緩解率甚低，預(yù)后不良［3］。由于MM分泌異常免疫球蛋白的種類和數(shù)量不同，臨床常用血清蛋白電泳和免疫固定電泳技術(shù)（immunofixation electrophoresis，IFE）來檢測(cè) MM患者血清 M蛋白，并對(duì)MM進(jìn)行診斷和分型，而目前毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）運(yùn)用于MM免疫分型分析的報(bào)導(dǎo)國內(nèi)尚不多見。為了探討CE技術(shù)對(duì)MM診斷的應(yīng)用價(jià)值，本文對(duì)51例MM患者采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 （capillary zone electrophoresis，CZE）進(jìn)行血清蛋白電泳和采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（immunosubtraction capillary zone electrophoresis，IS－CZE）進(jìn)行免疫分型，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 來自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年10月－2010年10月本院MM住院患者的血清標(biāo)本，共51例，其中男33例，女18例，年齡在38－82歲之間，診斷均符合國家診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。靜脈取全血，分離后血清標(biāo)本置－20℃冰箱待用。

1.1.2 儀器與試劑 血清蛋白電泳和毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（IS－CZE）電泳均采用法國sebia公司sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)，版本為6.1.2，毛細(xì)管電泳試劑包括血清蛋白電泳試劑CAPILLARYS PROTEIN（Eβ1＋β2），批號(hào)為22090／01；IS－CZE試劑 CAPILLARYS IMMUNOTYPING，批號(hào)為15040／01。所用試劑均為原裝配套試劑。免疫球蛋白定量使用HITACHI日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，試劑由上海執(zhí)誠提供。采用法國sebia公司HY－drasys電泳儀進(jìn)行免疫固定電泳分析，試劑為原裝配套試劑。

1.2 方法

1.2.1 毛細(xì)管血清蛋白電泳 使用sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)電泳儀進(jìn)行分析，方法為毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）。將待檢血清和樣品稀釋小杯置于樣品架上，檢測(cè)程序選擇“血清蛋白6”全自動(dòng)進(jìn)樣和分析，產(chǎn)生6個(gè)峰，分別為白蛋白，α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ球蛋白。健康人結(jié)果見圖1。

圖1 健康人毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果

1.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（IS－CZE） 使用sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)電泳儀進(jìn)行分析。將待檢血清和抗體小杯（含ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清）置于樣品架上，檢測(cè)程序選擇“免疫分型”全自動(dòng)進(jìn)樣和分析，每個(gè)樣本共生成6個(gè)圖像，分別對(duì)應(yīng)的是依次加了ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。

1.2.3 免疫球蛋白定量 采用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 免疫固定電泳（IFE） 對(duì)患者血清樣本進(jìn)行稀釋，各取10μl加入加樣梳內(nèi)，保濕5min后電泳。裝好加樣模板，依次加入抗血清ELP、抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清各10μl，電泳結(jié)束后進(jìn)行免疫固定程序約5min，染色后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果 51例MM患者中，有50例血清蛋白電泳檢測(cè)出α、β區(qū)或γ區(qū)或β區(qū)和γ之間出現(xiàn)底部狹窄，高尖的M蛋白峰（峰高大于或等于2倍峰寬）。檢測(cè)結(jié)果見表1。

2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果 樣品分別與抗體小杯中的ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清混合，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，經(jīng)過生成抗原抗體復(fù)合物的樣品再分別進(jìn)入不同的毛細(xì)管進(jìn)行電泳，得到6個(gè)電泳圖譜，其中形成了復(fù)合物的蛋白在電泳圖譜中被消除。所以，如果在加入了某種抗體的電泳結(jié)果圖譜中，M蛋白峰消失，即為該種類型的M蛋白峰，判斷為該種類型的MM，得出其免疫分型，見圖2和圖3。M蛋白免疫分型結(jié)果為IgG31例，其中IgGκ型16例，IgGλ型15例；IgA型10例，其中IgAκ型5例，IgAλ型5例；IgMκ型2例；單純輕鏈型7例，其中κ型4例，λ型3例；雙克隆型1例。51例MM血清毛細(xì)管電泳免疫分型結(jié)果如表2。

圖2 患者IS－CZE電泳圖譜，分別是加了ELP，抗IgG、IgA、IgM，抗κ血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。在加入了抗IgG和抗λ血清的圖中M峰消失，檢測(cè)結(jié)果為IgG＋λ型

圖3 患者IS－CZE電泳圖譜，分別是加了ELP，抗IgG、IgA、IgM，K血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。在加入了抗IgA和抗κ血清的圖中M峰消失，檢測(cè)結(jié)果為IgA＋κ型

2.3 免疫球蛋白定量結(jié)果 51例MM患者中，有1例IgAκ型和1例IgMκ型患者表現(xiàn)為IgG含量升高，其余與毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果相符。

2.4 免疫固定電泳結(jié)果 免疫固定電泳結(jié)果與毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果相符。

2.5 51例MM患者入院初診斷分析 對(duì)51例MM患者病例資料的回顧性分析結(jié)果顯示，MM的臨床首發(fā)癥狀多樣化，可表現(xiàn)為腎臟損害、貧血、骨折、感染和心血管疾病等癥狀，由腎病綜合征、腎功能不全入院者15例（29.4%），由貧血、出血等入院者13例（25.5%），由肝病入院者10例（19.6%），其它原因較少，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表3。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞惡性增生性疾病，以中老年好發(fā)，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［5，6］。臨床上的患者多因腎病、貧血、出血和骨病等表現(xiàn)就診，由于其臨床癥狀的不典型和多樣化，而且骨髓穿刺瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查受穿刺部位、穿刺次數(shù)影響，不利于MM的早期診斷及治療。提高早期診斷率，對(duì)MM的治療具有重要意義。

表1 51例MM患者毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果及M帶出現(xiàn)區(qū)域

表2 51例MM患者血清IS－CZE電泳結(jié)果

表3 51例MM患者入院原因及入住科室分布

血清中出現(xiàn)M蛋白是MM診斷重要依據(jù)之一。M蛋白是單株漿細(xì)胞惡性增殖分泌的結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白或其肽鏈亞單位，可分為lgG，IgA，IgM，lgD，IgE，游離輕鏈κ，λ7種類型，其檢出對(duì)MM的分型、病情、預(yù)后具有重要意義［7］。目前臨床上使用免疫比濁法進(jìn)行免疫球蛋白定量檢測(cè)以確定M蛋白的種類和數(shù)量，但是不能區(qū)分是否由巨球蛋白血癥、漿細(xì)胞性白血病等其它疾病造成的免疫球蛋白增高［8］；或使用以瓊脂糖凝膠作為遷移支持物的瓊脂糖凝膠電泳法（agar gel electrophoresis，AGE）進(jìn)行血清蛋白電泳和免疫固定電泳作為檢測(cè)M蛋白的重要手段，但是由于存在著技術(shù)的局限性和手工加樣的操作誤差，不同的實(shí)驗(yàn)室使用AGE法進(jìn)行電泳得出的檢測(cè)結(jié)果存在差異。故本研究使用毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）對(duì)51例 MM患者血清進(jìn)行分析，探討CE技術(shù)對(duì)MM診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

使用毛細(xì)管電泳技術(shù)分別對(duì)MM患者進(jìn)行血清蛋白電泳和IS－CZE電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS－CZE電泳可檢出全部血清中M蛋白峰，且與IFE結(jié)果相符；血清蛋白電泳存在一例漏檢。血清蛋白電泳具有一定的局限性，首先是不能區(qū)分M蛋白峰和其它蛋白峰，例如慢性肝炎病人在γ區(qū)或β－γ連接區(qū)間出現(xiàn)較鈍圓的峰，或者腎病綜合癥病人在α區(qū)和（或）β區(qū)出現(xiàn)的高尖的峰；其次為不能區(qū)分M蛋白峰的類型。利用IS－CZE進(jìn)行的免疫分型電泳則可鑒別M蛋白免疫類型。本實(shí)驗(yàn)分型結(jié)果顯示IgG型（60.8%）最多，IgA 型（19.6%）和輕鏈型（13.7）次之，IgM 型（3.9%）少見，雙克隆型（2.0%）最少見，與國內(nèi)劉玉梅［9］等的報(bào)道基本一致，但各類型百分比和輕鏈類型仍有差別，分析原因可能與地域差異和樣本量較小有關(guān)。因?yàn)镸M的治療方式與其免疫分型相關(guān)，故根據(jù)免疫球蛋白對(duì)MM進(jìn)行準(zhǔn)確的免疫分型對(duì)患者的治療具有重要意義。所以利用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行MM的免疫分型對(duì)其診斷和治療均具有較高臨床價(jià)值。另外，有研究表明，毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）是一種靈敏度、精確度更高的實(shí)驗(yàn)方法［1，10］，毛細(xì)管電泳技術(shù)在實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的基礎(chǔ)上，儀器還可以識(shí)別患者樣品條形碼，與免疫固定電泳技術(shù)（IFE）相比具有分析時(shí)間更短，分辨率高，基線噪音低等優(yōu)點(diǎn)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程，使操作更加方便快捷［11，12］。

綜上所述，毛細(xì)管電泳技術(shù)中血清蛋白電泳可用于初步篩查是否存在M蛋白，IS－CZE電泳則可鑒別M蛋白免疫類型，對(duì)鑒定M蛋白血癥有較高的應(yīng)用價(jià)值。目前尚無早期診斷MM的方法，對(duì)臨床上不明原因的骨痛、貧血患者，和血清總蛋白、免疫球蛋白異常升高的患者應(yīng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，陽性結(jié)果可作為診斷MM的重要依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)早診斷早治療的目的。

［1］陳 燕，黃澤玉，王雅杰，等.全自動(dòng)多通道毛細(xì)管區(qū)帶電泳法在血清蛋白分析中的臨床應(yīng)用［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，（29）5，420.

［2］王 瑞，梁生旺，衛(wèi)軍波，等.高效毛細(xì)管電泳及其在中藥成分分析中的應(yīng)用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10：61.

［3］田永芳，賈海英，田洪燕.47例多發(fā)性骨髓瘤綜合分析［J］.臨床血液學(xué)雜志，2010，23（8）：472.

［4］張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京：科學(xué)出版社，1998：378－380.

［5］盧娉霞，陳 鶯，張敬喜.免疫固定電泳在多發(fā)性骨髓瘤免疫分型中的應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27（3）：267.

［6］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61：212.

［7］翟洪順，林麗淑，鄒德學(xué)，等.多發(fā)性骨髓瘤的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)對(duì)臨床治療和預(yù)后的意義［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（4）：675.

［8］Mussap M，Pietrogrande F，Ponchia S，et al.Measurement of serum monoclonal components：comparison between densitometry and capillary zone electrophoresis［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44：609.

［9］劉玉梅，趙有利，石 種，等.107例多發(fā)性骨髓瘤M蛋白檢測(cè)與免疫學(xué)分型分析［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（4）：132.

［10］黃澤玉，陳 燕.全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法和瓊脂糖凝膠法檢測(cè)一例多發(fā)性骨髓瘤患者血清蛋白結(jié)果變化［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：77.

［11］Kalambokis G，Kalogera C，Kolios G，et al.Inherited bisalbuminemia with begin monoclonal gammopathy detected by capillary but not agarose gel electrophoresis［J］.Clin Chem，2002，48：2076.

［12］Ivanova M，Tzvetanova E，Jetcheva V，et al.Abnormal protein patterns in blood serum and cerebrospinal fluid detected by capillary electrophoresis［J］.J Biochem Biophys Methods，2002，53（1－3）：141.