劉 饒，蔣燕鋒，許元科，毛昌會(huì)

（1.浙江省景寧縣科技開(kāi)發(fā)服務(wù)部，浙江 景寧 323500；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；3.浙江省景寧縣林業(yè)局，浙江 景寧 323500）

景寧木蘭（Magnolia sinostellata）是1984年發(fā)現(xiàn)、1989年定名的木蘭屬新種[1～2]。在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)景寧木蘭座果率和種子產(chǎn)量不高，嚴(yán)重影響了該珍稀瀕危植物的大范圍栽培和開(kāi)發(fā)利用。植物受精成敗受花粉活力、柱頭生活力和環(huán)境溫度、濕度等影響?；ǚ凼沁z傳信息的載體，是自然條件下種子植物遺傳信息交流的工具，其生活力直接影響植物授粉受精乃至座果[3]。其活力測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性決定細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和雜交育種的成敗，可為植物推廣種植時(shí)授粉品種的遴選及生產(chǎn)中制定花期噴硼的促果技術(shù)提供依據(jù)。因此，花粉生活力測(cè)定方法及測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)一直是育種關(guān)注的問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為景寧木蘭花粉，在景寧木蘭花苞半開(kāi)放期，選取樹(shù)冠中上部陽(yáng)面的健康花枝，在室內(nèi)進(jìn)行水培，待其花粉自然成熟時(shí)收集，于4℃的冰箱及室溫下保存，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用TTC法、過(guò)氧化物酶測(cè)定法及花粉發(fā)芽法測(cè)定景寧木蘭花粉活力。TTC法、過(guò)氧化物酶測(cè)定法均觀察3個(gè)制片，每片取3個(gè)視野；花粉發(fā)芽法每個(gè)處理觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100粒。花粉萌發(fā)以其花粉管伸長(zhǎng)超過(guò)花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)花粉發(fā)芽率，取平均值為結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 景寧木蘭花粉活力測(cè)定方法確定

利用TTC法進(jìn)行花粉生活力的測(cè)定具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但是受到花粉自身因素的影響較大，例如花粉壁薄厚，花粉外壁的組成物質(zhì)，花粉內(nèi)各種酶活性等。因此，不同的染色方法只適合于某些植物花粉生活力的測(cè)定，不同的染色劑對(duì)同一品種的花粉染色率是不同的。景寧木蘭花粉經(jīng)0.5%TTC溶液染色之后，顯現(xiàn)出淡紅色居多。但是其顏色穩(wěn)定性較差，染色效果不理想，并且有生活力和無(wú)生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不適合用于景寧木蘭花粉生活力的測(cè)定。

試驗(yàn)中也觀察到過(guò)氧化物酶測(cè)定法測(cè)定景寧木蘭花粉生活力的效果不明顯，其測(cè)定結(jié)果相對(duì)于花粉發(fā)芽法明顯偏高。因此，進(jìn)一步試驗(yàn)均以花粉離體培養(yǎng)法進(jìn)行。

2.2 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)法測(cè)定景寧木蘭花粉活力

2.2.1 最適宜觀測(cè)時(shí)期的確定 在景寧木蘭花粉萌發(fā)速度和伸長(zhǎng)速度達(dá)到穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行花粉生活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)可以使統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。為了探索景寧木蘭花粉萌發(fā)速度及花粉管伸長(zhǎng)速度達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn)，本試驗(yàn)對(duì)其離體萌發(fā)情況進(jìn)行了跟蹤測(cè)定。結(jié)果表明，景寧木蘭花粉培養(yǎng)2 h就開(kāi)始萌發(fā)，10 h萌發(fā)率上升到了68.22%，其后萌發(fā)率緩慢增加，14 h達(dá)到了78.25%；14 ～ 16 h萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，花粉萌發(fā)逐漸停止。由此可見(jiàn)，進(jìn)行花粉萌發(fā)率測(cè)定的最適合時(shí)間點(diǎn)是培養(yǎng)12 h以后。景寧木蘭花粉培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下已可清晰辨認(rèn)，14 h后彼此相互交錯(cuò)延伸，使花粉粒的統(tǒng)計(jì)變得越來(lái)越困難。所以，綜合萌發(fā)率和伸長(zhǎng)速度的變化情況，以花粉管培養(yǎng)14 h內(nèi)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)最合適。

2.2.2 不同蔗糖濃度對(duì)景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響 蔗糖對(duì)景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響見(jiàn)表1。從表中可以看出，景寧木蘭花粉的萌發(fā)對(duì)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度有較為嚴(yán)格的要求，有明顯的域值效應(yīng)。萌發(fā)率從高到低依次為蔗糖濃度5%，0%，10%，15%，20%。蔗糖濃度以5%時(shí)最為適宜，此時(shí)景寧木蘭花粉的萌發(fā)率高達(dá)93.96%；低于5%的蔗糖濃度花粉萌發(fā)率與5%較為接近；然而蔗糖濃度 15%時(shí)反而不利于花粉的萌發(fā)，其萌發(fā)率降為17.41%；蔗糖濃度為20%時(shí)，花粉出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，花粉不能萌發(fā)。

經(jīng)方差分析表明，不同蔗糖濃度對(duì)景寧木蘭花粉萌發(fā)率的影響差異顯著，且花粉萌發(fā)率在蔗糖濃度5%時(shí)極顯著高于其他4個(gè)濃度。該結(jié)果表明，蔗糖濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制花粉的萌發(fā)，5%的蔗糖濃度對(duì)景寧木蘭花粉的離體培養(yǎng)較為適宜。

2.2.3 不同硼酸濃度對(duì)景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響 硼酸可增加氧的吸收以及促進(jìn)糖的吸收和代謝，利于果膠的合成，因而對(duì)花粉的萌發(fā)起促進(jìn)作用。表2結(jié)果顯示，加入少量硼酸能夠提高花粉的萌發(fā)率。隨著硼酸濃度的增加，花粉的萌發(fā)率有所上升，當(dāng)硼酸的濃度為 0.01%時(shí)，花粉的萌發(fā)率最高，達(dá)到86.64%。之后隨硼酸濃度的增加，花粉的萌發(fā)率顯著下降。由此可見(jiàn)，過(guò)量的外源硼對(duì)景寧木蘭花粉的萌發(fā)有抑制作用。

方差分析表明，不同硼酸濃度對(duì)景寧木蘭花粉萌發(fā)率的影響差異顯著，且花粉萌發(fā)率在硼酸濃度 0.01%時(shí)極顯著高于其他濃度。0%和0.03%硼酸濃度下萌發(fā)率差異不顯著，該結(jié)果表明，低濃度的硼酸培養(yǎng)基有利于花粉的萌發(fā)，硼酸濃度過(guò)高時(shí)反而會(huì)抑制花粉的萌發(fā)，0.01%的硼酸濃度對(duì)景寧木蘭花粉的離體培養(yǎng)較為適宜。

表1 不同蔗糖濃度下景寧木蘭花粉的萌發(fā)率Table1 Pollen germination rate of M.sinostellata with different sucrose concentration%

表2 不同硼酸濃度下景寧木蘭花粉的萌發(fā)率Table2 Pollen germination rate of M.sinostellata with different borax concentration%

2.3 溫度與儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)花粉生活力的影響

一般來(lái)說(shuō)花粉的生活力會(huì)隨著貯藏時(shí)間的增加而降低，不同的貯藏方法在保持花粉生活力方面會(huì)有所不同。為此對(duì)采集的景寧木蘭花粉在室內(nèi)常溫貯藏和4℃冰箱冷藏保存條件下進(jìn)行了生活力觀察。

表3結(jié)果顯示，4℃低溫下儲(chǔ)藏的景寧木蘭花粉，其花粉發(fā)芽率高于室溫下儲(chǔ)藏的花粉。常溫下，花粉在第16 ～ 20 d時(shí)，就基本上喪失了活力，而在4℃低溫下，花粉的活力延長(zhǎng)到了26 ～ 30 d，低溫儲(chǔ)藏10 d內(nèi)，花粉活力≥75%。景寧木蘭花粉無(wú)論是在常溫還是 4℃低溫條件下，從采集花粉的當(dāng)天開(kāi)始，花粉活力就開(kāi)始下降。景寧木蘭花粉在采集后的幾天內(nèi)，由于花粉剛脫離母體，失去了水分、營(yíng)養(yǎng)等供應(yīng)，貯藏的最初10 d內(nèi)活力下降較快。室內(nèi)常溫貯藏10 d，其活力由93.95%下降到28.29%，每天下降6.57百分點(diǎn)；4℃冰箱冷藏保存10 d，花粉生活力由93.95%下降到78.55%，日平均下降 1.54百分點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)景寧木蘭的花粉活力有影響，4℃低溫確實(shí)能使景寧木蘭的花粉保持相對(duì)較高的活力，但是所能延長(zhǎng)的時(shí)間并不久。

表3 不同溫度和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)花粉發(fā)芽率的影響Table3 Effect of different temperature and storage duration on pollen germination rate%

3 討論

3.1 TTC法和過(guò)氧化物酶測(cè)定法不適合景寧木蘭花粉生活力測(cè)定

通過(guò)對(duì)測(cè)定結(jié)果的分析認(rèn)為，TTC法測(cè)定景寧木蘭花粉時(shí)其顏色穩(wěn)定性較差，染色效果不理想，并且有生活力和無(wú)生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不適合用于景寧木蘭花粉生活力的測(cè)定。過(guò)氧化物酶測(cè)定法測(cè)定景寧木蘭花粉生活力的效果也不明顯，測(cè)定結(jié)果相對(duì)于花粉發(fā)芽法明顯偏高。

3.2 適宜的硼酸濃度可以促進(jìn)花粉萌發(fā)

硼酸對(duì)于花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的主要成分[4]。Jackson等人在以矮牽牛為試材的研究中也發(fā)現(xiàn)，在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)有硼酸時(shí)，有利于更多的蛋白質(zhì)組裝成膜和壁的成分，而膜和壁是花粉管生長(zhǎng)的必須成分，因而有利于花粉管的生長(zhǎng)。迄今有關(guān)硼酸對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的研究均認(rèn)為，一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)[5]。但不同植物種類的花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)所需的最適硼酸濃度不同。研究結(jié)果表明，在添加硼酸的培養(yǎng)基內(nèi)景寧木蘭花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均有所提高，但高濃度則起抑制作用，其最佳濃度為0.01%。

3.3 適宜的蔗糖濃度可以促進(jìn)花粉萌發(fā)

蔗糖對(duì)花粉的萌發(fā)具有兩方面作用，一是為花粉的萌發(fā)及花粉管的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，二是維持外界環(huán)境一定的滲透壓。蔗糖能進(jìn)入花粉并增大細(xì)胞內(nèi)已很高的內(nèi)源濃度。所以，高濃度的蔗糖能改變花粉管的透性，導(dǎo)致代謝物和離子泄露在培養(yǎng)基里，反而對(duì)萌發(fā)不利。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了一樣的結(jié)果，供試景寧木蘭花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而升高，在濃度為5%時(shí)，萌發(fā)率最高，大于5%時(shí)，萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增大而降低，蔗糖濃度15%時(shí)其萌發(fā)率降為19.55%，蔗糖濃度為20%時(shí)，花粉出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，花粉不能萌發(fā)。

3.4 適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏可以延長(zhǎng)景寧木蘭花粉的壽命

試驗(yàn)結(jié)果表明，4℃低溫不僅能使花粉保持較高活力，還可以有效延長(zhǎng)花粉的保存時(shí)間。常溫下景寧木蘭的花粉生命力下降極快，保存16 ～ 20 d就幾乎全部喪失生命力。而4℃低溫使得花粉的壽命延長(zhǎng)到26 ～ 30 d。

[1]裘寶林，陳征海.浙江木蘭屬新種[J].植物分類學(xué)報(bào)，1989，27（1）：79－80.

[2]斯金平，蔡通愛(ài).珍稀瀕危植物景寧木蘭[J].浙江林業(yè)科技，1998，18（1）：68－71.

[3]王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測(cè)定[J].植物學(xué)通報(bào)，2002，19（3）：365－373.

[4]胡晉.花粉的保存和生活力測(cè)定[J].種子，1992（6）：33－36.

[5]符碧.尿素和硼及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)荔枝花粉萌發(fā)與生長(zhǎng)的影響[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2001（3）：62－65.