徐 寧，秦俊蓮，孫樹剛，段舜山

暨南大學水生生物研究中心，廣州510632

有害藻華與富營養(yǎng)化關(guān)系的研究是國際上近海海洋生態(tài)學研究的熱點.近年來，沿岸海域的有機污染程度不斷加重，溶解有機氮 (dissolved organic nitrogen，DON)，尤其是尿素 (CO(NH2)2)的含量快速增長［1-3］.同時，赤潮災(zāi)害也呈現(xiàn)出頻率和類型增多、分布區(qū)域和規(guī)模擴大、危害日趨嚴重的演變趨勢.研究顯示，某些赤潮藻類能夠利用尿素和一些溶解氨基酸［4］;海水中DON濃度的上升與赤潮頻率的增加密切相關(guān)［5-6］.

東海原甲藻是近年引發(fā)中國沿海頻繁赤潮的原因種之一［7］，嚴重危害了漁業(yè)生產(chǎn)、公眾健康和近海環(huán)境［8-10］.研究顯示，發(fā)生赤潮的長江口及鄰近海域受人類活動的影響，營養(yǎng)鹽含量很高［11］.然而，迄今為止，DON在東海原甲藻赤潮生長、消亡過程中的作用仍不清楚.本研究比較了東海原甲藻對尿素和無機氮源的吸收動力學和生長特性，以期為闡明赤潮藻對重要DON組分的利用策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗藻種為中國沿海典型赤潮藻東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，采自我國東海赤潮高發(fā)海區(qū)，經(jīng)毛細管分離培養(yǎng)成單細胞株系.

1.2 培養(yǎng)條件

試驗藻種于LRH-400-G室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度 (23±1)℃，輻照強度約25 W/m2，光暗比12∶12.選用f/2培養(yǎng)基，基礎(chǔ)介質(zhì)為人工海水(鹽度為30.5‰).

1.3 東海原甲藻在不同N源下的生長動力學特征

分別以CO(NH2)2或NaNO3為N源經(jīng)3輪或以上預(yù)培養(yǎng).具體方法為:將指數(shù)生長期的藻細胞分別接種至N質(zhì)量濃度為500 μg/L的CO(NH2)2或NaNO3培養(yǎng)基中，另添加NaH2PO4，使P的質(zhì)量濃度為100 μg/L，其他組分同f/2培養(yǎng)基.至培養(yǎng)基中檢測不出 N，分別接種至不同 N濃度 (0 μmol/L、1.764 μmol/L、4.410 μmol/L、8.820 μmol/L、44.100 μmol/L、88.200 μmol/L、441 μmol/L、882 μmol/L 和 8 820 μmol/L) 的 CO(NH2)2或NaNO3培養(yǎng)基中 (其他組分同f/2培養(yǎng)基)，置于室內(nèi)同一光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一處理設(shè)3個平行.每隔24 h取藻液5 mL觀察計數(shù)并測定其光密度值OD680，采用Guillard的計算方法確定比生長率 μ (單位為 d－1)［12］.

1.4 東海原甲藻對尿素的吸收動力學特征

分別以CO(NH2)2或NH4Cl為N源經(jīng)過3輪或以上預(yù)培養(yǎng).具體方法同上.

時間序列實驗.將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的藻細胞分別接種于3個1 000 mL三角瓶中，密度1 000/mL，終體積為600 mL，分別添加CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使N的濃度為6 μmol/L.充分混勻后，立即抽取10 mL藻液，經(jīng)孔徑為0.7 μm的GF/F玻璃纖維濾紙過濾 (Whatman)，將濾液收集到20 mL聚乙烯瓶中冷凍保存;同樣，分別于2 min、5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min時抽取并過濾藻液，冷凍保存.用AA3連續(xù)流動化學元素分析儀 (Bran Luebbe)測定濾液中N濃度.

濃度序列實驗.將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的東海原甲藻分別接種于3個1 000 mL三角瓶中，密度為1 000/mL，終體積為400 mL，然后按每瓶50 mL藻液分裝至100 mL的三角瓶中.加入 CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使 N濃度依次為:0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、12.0 μmol/L 和 18.0 μmol/L，2 min時用孔徑為0.7 μm的 GF/F玻璃纖維濾紙過濾(Whatman抽取10 mL藻液)，濾液冷凍保存，每種處理設(shè)3個平行.用同樣方法測定N濃度.

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，t檢驗比較各處理之間的差異顯著性.

利用Monod方程描述東海原甲藻比生長率與N濃度間的關(guān)系其中，μ為比生長率 (單位d－1);μm為最大比生長率 (單位d－1);c(N)為培養(yǎng)液中 N濃度 (單位μmol/L);K為半飽和常數(shù) (單位μmol/L).

將方程(1)整理成c(N)/μ =K/μm+c(N)/μm.利用最小二乘法求出方程的斜率(1/μm)和截距(K/μm)，斜率的倒數(shù)與截距的乘積即為半飽和常數(shù)K.

利用經(jīng)修改的Michaelis-Menten方程描述東海原甲藻對N的吸收速率與培養(yǎng)液中N濃度間的關(guān)系

其中，V為吸收速率 (單位h－1);Vm為最大吸收速率.同樣，利用最小二乘法求出半飽和常數(shù)K.

2 結(jié)果與分析

2.1 東海原甲藻對尿素N和硝態(tài)N的利用特征

圖1為不同濃度尿素N下東海原甲藻生長情況.結(jié)果顯示，尿素N能較好地被東海原甲藻利用，且其濃度與東海原甲藻生長速率呈明顯正相關(guān).c(N)分別為441 μmol/L和882 μmol/L時，實驗組東海原甲藻生長速率顯著大于其他組(P＜0.05);c(N)=8 820 μmol/L時，實驗組生長速率和最大細胞密度顯著低于c(N)為882 μmol/L和441 μmol/L組(P＜0.05)，表明過高N濃度抑制東海原甲藻生長.當尿素N的濃度低于8.820 μmol/L時，東海原甲藻種群生長緩慢.

圖1 不同濃度尿素N下東海原甲藻的生長曲線Fig.1 Effect of urea concentration on the growth of P.donghaiense

如圖2，將東海原甲藻的μm和尿素N濃度擬合Monod方程，得雙曲線方程μ=0.685c(N)/［20.508+c(N)］，R2=0.866 33.由此可知，東海原甲藻種群最大比生長速率為0.685/d，半飽和尿素N的濃度為20.508 μmol/L.

由圖3可見，NaNO3能較好地被東海原甲藻利用，且其濃度與藻細胞生長速率呈明顯正相關(guān).c(N)=8 820 μmol/L時，實驗組藻細胞生長最好;其次是c(N)=882 μmol/L組;再次是c(N)=441 μmol/L組 (P ＜ 0.05).c(N)為 88.200 μmol/L 和44.100 μmol/L時，實驗組藻細胞生長速率均明顯降低(P＜0.05).N濃度低于8.820 μmol/L時，實驗組藻細胞生長緩慢.但c(N)=8 820 μmol/L時，東海原甲藻并未像尿素一樣出現(xiàn)抑制生長現(xiàn)象.

如圖4，將指數(shù)生長期的東海原甲藻 μ和c(NaNO3)擬合Monod方程，得雙曲線方程μ=0.663c(N)/［11.940+c(N)］，R2=0.896 70.由此可知，東海原甲藻種群的μm為0.663/d，此時半飽和NaNO3濃度為11.940 μmol/L.相對而言，東海原甲藻在CO(NH2)2下的μm較高，而K略低，可見東海原甲藻能有效利用CO(NH2)2，并在N源充足時，可獲得更高的繁殖速率.

圖2 東海原甲藻在尿素N下的生長動力學曲線Fig.2 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of urea concentrations

圖3 不同濃度硝態(tài)氮下東海原甲藻的生長曲線Fig.3 Effect of nitrate concentration on the growth of P.donghaiense

2.2 東海原甲藻對尿素N和氨態(tài)N的吸收動力學特征

時間變化特征.圖5顯示，向N已耗盡的東海原甲藻培養(yǎng)液中一次添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N濃度為6 μmol/L時，隨時間延長，培養(yǎng)液中N濃度和藻細胞對N的吸收速率均迅速衰減.向培養(yǎng)液中添加CO(NH2)210 min后，其濃度降低至原來的60%;30 min時，其濃度繼續(xù)降低，至原來的40%;60 min時，其濃度的下降趨勢不明顯.向培養(yǎng)液中添加NH4Cl 10 min后，其濃度降低到原來的45%;20 min時，濃度繼續(xù)降低，至原來的40%;30 min時，其濃度繼續(xù)下降，低至原來的30%;60 min時，其濃度下降變得不明顯.可見，處于N耗盡狀態(tài)的藻細胞對水體中N的輸入非常敏感，可在第一時間迅速吸收并儲存N源.然而，快速吸收期非常短，僅維持約30 min;60 min后吸收速率已衰減85%，且吸收緩慢.對比兩者表明，向處于N耗盡狀態(tài)的東海原甲藻培養(yǎng)液中一次性添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N濃度為6 μmol/L時，東海原甲藻對氨態(tài)N的吸收速率高于對尿素N的吸收速率.

圖4 東海原甲藻硝態(tài)N下的生長動力學曲線Fig.4 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of nitrate concentrations

圖5 東海原甲藻培養(yǎng)基中N濃度隨時間的變化Fig.5 Changes of urea and ammonium concentrations in P.donghaiense medium over time

濃度響應(yīng)特征.圖6和圖7顯示，向N耗盡的培養(yǎng)液中一次添加不同濃度的CO(NH2)2或NH4Cl，添加2 min后，東海原甲藻對N的吸收速率與N濃度呈正相關(guān).將東海原甲藻對尿素N或氨態(tài)N的吸收速率與其相應(yīng)濃度擬合Michaelis-Menten方程，得雙曲線方程

由此可知，2 min時東海原甲藻對尿素N的最大吸收速率為 3.184/h，半飽和 N濃度為 39.043 μmol/L(見表1和圖6);對氨態(tài)N的最大吸收速率為 2.800/h，此時半飽和 N濃度為 18.032 μmol/L(見表1和圖7).

表1 東海原甲藻對CO(NH2)2和NH4Cl的吸收動力學參數(shù)Table 1 Uptake kinetics of P.donghaiense for urea and ammonium

圖6 東海原甲藻在不同濃度尿素N下的吸收速率Fig.6 Uptake rates of P.donghaiense as a function of urea

研究表明，東海原甲藻能有效利用CO(NH2)2和NH4Cl兩種N源.相對而言，對NH4+的親和力較高，表現(xiàn)為較低的半飽和常數(shù)K和較高的競爭系數(shù)α，在低N濃度下具有較高的吸收速率;對尿素的最大吸收速率較高，表現(xiàn)為隨著N濃度的增加吸收速率持續(xù)增大.根據(jù)擬合方程 (3)和方程 (4)的結(jié)果，隨著N濃度增加，東海原甲藻對尿素N的吸收速率會超過銨N，主要原因可能是高濃度NH4+對藻類具有毒害作用.

圖7 東海原甲藻在不同濃度氨態(tài)N下的吸收速率Fig.7 Uptake rates of P.donghaiense as a function of ammonium concentrations

3 討論

3.1 赤潮藻具備高效利用尿素的能力

本研究比較了東海原甲藻對 CO(NH2)2和NO3－的利用特征，結(jié)果表明，東海原甲藻能有效利用尿素，相對于無機氮，在尿素條件下的比生長速率更高.有研究證實，某些赤潮藻類能優(yōu)先利用尿素.如Fan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，美國切薩皮克灣的微小原甲藻(Prorocentrum minimum)即使在高NO3－濃度條件下，也會優(yōu)先選擇尿素.類似地，在低光條件下，3株Karenia brevis中2株對尿素氮的最大吸收速率高于氨態(tài)N和硝態(tài)N，且同化為蛋白質(zhì)的比例均以尿素氮最高［14］;Li等［15］發(fā)現(xiàn)Karenia mikimotoi也能優(yōu)先利用尿素.

本研究發(fā)現(xiàn)，當尿素N濃度達8 820 μmol/L時會抑制東海原甲藻生長，而同濃度硝態(tài)N卻沒有此現(xiàn)象.研究表明，大多數(shù)細菌中存在三磷酸腺苷脲酰胺酶，能將尿素分解為氨和碳酸氫根［3］.由于本研究使用的是未經(jīng)無菌處理的藻株，培養(yǎng)基中的細菌降解尿素并釋放出氨，過高濃度的氨可能對藻細胞直接產(chǎn)生毒害作用.另外，氨是脲酶活性的下行調(diào)節(jié)物［3，11］，可能抑制尿素轉(zhuǎn)移酶和脲酶活性，這不利于藻細胞攝取和利用尿素.Jauzein等［16］發(fā)現(xiàn)NH4+強烈抑制 Alexandrium catenella對尿素的吸收.在野外觀察中也發(fā)現(xiàn)，加入NH4+或環(huán)境中NH4+濃度增加，尿素的吸收速率會下降.如在切薩皮克灣，NH4+濃度為5 μmol/L時就會抑制尿素的吸收.

與NO3－相比，尿素是一種“節(jié)能型”N源.此外，赤潮藻在利用尿素N時，還能利用其中的碳源.這也可能是赤潮藻優(yōu)先利用尿素的原因之一.然而，浮游植物利用尿素性能的多樣性及其調(diào)控機制尚待深入研究.

3.2 浮游植物對尿素的吸收特征及生態(tài)學意義

研究結(jié)果顯示，東海原甲藻對尿素N的吸收速率與對氨態(tài)N吸收速率接近 (見圖6和圖7)，表明尿素可能在赤潮生長消亡過程中起關(guān)鍵作用.近期的研究結(jié)果顯示，許多赤潮種類對尿素具有很高的吸收速率.Collos等［17］在法國南部Thau瀉湖爆發(fā)的4次藻華期間進行現(xiàn)場實驗，比較了鏈狀亞歷山大藻對硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨和尿素的吸收速率，發(fā)現(xiàn)氨和尿素是促進亞歷山大鏈狀藻生長的主要N源.另外有研究指出，在加州沿海形成赤潮的有毒藻Lingulodinium polyedrum和Cochlodinium fulvescens吸收尿素及其降解產(chǎn)物氨的速率遠遠超過對硝酸鹽的吸收［10］.

營養(yǎng)組成對于刺激某些藻類的生長是十分重要的，一次突然的營養(yǎng)輸入可能引起浮游植物種類組成和相對豐度發(fā)生逆轉(zhuǎn).例如，美國 Northport-Huntington灣的Alexandrium fundyense赤潮與污水排入密切相關(guān)［18］.進一步的研究顯示，雨水和地表徑流中攜帶的有機物促進了水華的發(fā)生［19］.在澳大利亞Moreton灣的現(xiàn)場研究發(fā)現(xiàn)，尿素占總N吸收的比例與甲藻所占比例高度相關(guān).越來越多的文獻表明，當環(huán)境中尿素成為常見N素形態(tài)時，甲藻數(shù)量可能會激增［11］.

隨著沿海水域尿素濃度的不斷上升，尿素在浮游植物群落演替和赤潮生長、消亡過程中的作用不容忽視.而對于浮游植物吸收、利用尿素的性能和調(diào)控機制的研究，將有助于深入了解有害藻華的形成機制.

結(jié) 語

綜上研究可知:① 東海原甲藻能以尿素為唯一N源生長，其最大細胞密度與尿素濃度呈正相關(guān)，最大比生長率為 0.685/d，高于 NO3－的0.663/d.在N濃度為8 820 μmol/L時，尿素出現(xiàn)抑制生長的現(xiàn)象，而NO3－無此現(xiàn)象;② 東海原甲藻能有效吸收利用尿素和NH4+.相對而言，對尿素的最大吸收速率較高，而對NH4+的親和力較高;③由于東海原甲藻具備有效吸收利用尿素的能力，水體中尿素含量的升高甚至會引發(fā)赤潮.

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