鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病恒河猴胰島細(xì)胞數(shù)量的變化

朱 華，徐艷峰，劉 穎，黃 瀾，秦 川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

胰腺分為外分泌腺和內(nèi)分泌腺兩部分。外分泌腺分泌胰液，內(nèi)分泌腺由大小不同的細(xì)胞團(tuán)—胰島所組成，主要分泌胰島素，調(diào)節(jié)糖代謝。人和大、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島細(xì)胞按其染色和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，主要分為A細(xì)胞、B細(xì)胞、D細(xì)胞及 PP細(xì)胞，但各種細(xì)胞的比例不同。鏈脲佐菌素(STZ)能選擇性破壞B細(xì)胞而誘導(dǎo)不可逆糖尿病。本文在小劑量多次注射STZ成功誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，用免疫組化方法顯示各種胰島細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量變化，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 模型制備

成年恒河猴5只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，年齡4～6歲，體重(5.5～6.5)kg。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2007-001。動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2010-0030。模型制作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［1］。

1.2 標(biāo)本制備

模型動(dòng)物中的3只在給予STZ 19個(gè)月，1只動(dòng)物在給予STZ 20個(gè)月時(shí)處于瀕死狀態(tài)。動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥麻醉后股動(dòng)脈放血處死。取胰腺在10%中性甲醛固定，組織經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋。櫻花IVS410切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度4 μm，每隔5片取連續(xù)的4片貼在防脫載玻片上，50℃烤箱內(nèi)烘烤過(guò)夜。取毒性試驗(yàn)正常對(duì)照組動(dòng)物胰腺作為對(duì)照，切片處理與模型動(dòng)物相同。

1.3 免疫組化染色

切片經(jīng)脫蠟、水化、蒸餾水洗，進(jìn)行 SP法免疫組化染色。步驟:(1)3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫 10 min，PBS洗。(2)正常血清封閉 15 min，滴加第一抗體(rabbit anti-insulin，Santa公司產(chǎn)品，貨 號(hào) SC-9618，稀 釋 度 1∶300;mouse antiglucagon，福建邁新，貨號(hào) BM1621，稀釋度 1∶200;rabbit anti-somatostatin，北京中杉金橋，貨號(hào) ZA-0232，稀釋度 1∶150;rabbit anti-polypeptide，北京中杉金橋，貨號(hào) ZA-0211，稀釋度 1∶100)，4℃ 過(guò)夜，PBS洗。(3)滴加第二抗體(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金橋，貨號(hào) PV-9001，PV-9002)，室溫孵育 30 min，PBS 洗。(4)DAB顯色1～5 min(北京中杉金橋，貨號(hào) ZLI-0001)，顯微鏡下控制顯色程度，蒸餾水終止顯色。(5)蘇木素襯染后脫水、透明、中性樹膠封片。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

切片光鏡下觀察后用Aperio切片掃描系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行掃描，隨機(jī)截取5個(gè)高倍視野(400×)，采用Image-Pro PLUS圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和光密度值(IOD)進(jìn)行分析。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)3張切片，取平均值。數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種細(xì)胞的比例

對(duì)照組組 A、B、D、PP四種細(xì)胞的比例約為21%、73%、5%、1%。模型組四種細(xì)胞的比例為58% 、32% 、8% 、2%(圖 1)。

圖1 胰島各細(xì)胞比例Fig．1 Percentage composition of the pancreas islet cells in the control and model groups．

2.2 免疫組化

結(jié)果可見(jiàn)B細(xì)胞胞質(zhì)在對(duì)照組中呈深棕色，分布在胰島中央?yún)^(qū)。模型組中B細(xì)胞胞質(zhì)著色變淺(圖2A，C)，胰島素表達(dá)減少。細(xì)胞核藍(lán)色。剩余細(xì)胞肥大，分布雜亂。模型組A細(xì)胞增生，細(xì)胞變密集，分布于胰島周邊部位，在模型組與對(duì)照組中均呈現(xiàn)為較深的棕色顆粒(圖2B，D，見(jiàn)彩插1)。對(duì)照組D細(xì)胞數(shù)量較少，分布在胰島 A、B細(xì)胞中間。模型組 D細(xì)胞增生，生長(zhǎng)抑素表達(dá)增多(圖3A，C)。對(duì)照組PP細(xì)胞體積較小，數(shù)量極少，分布在胰島周邊部位。模型組PP細(xì)胞增生，胰多肽表達(dá)增多(圖3B，D，見(jiàn)彩插2)。

2.3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及光密度值

模型組B細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及光密度值較對(duì)照組顯著減少(P＜0.01)。模型組A細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及光密度值比對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)。D細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及光密度值比對(duì)照組增高，但差異無(wú)顯著性。模型組動(dòng)物PP細(xì)胞顯著增生，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及光密度值較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)(表 1)。

表1 胰島細(xì)胞表達(dá)情況及細(xì)胞光密度值Tab．1The expression of pancreatic islet cells and IOD of the two groups(ˉx±s，n=4)

3 討論

自80年代以來(lái)1型糖尿病的自身免疫學(xué)說(shuō)已確立［2］。根據(jù)多方面的綜合研究，已知它是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。胰島B細(xì)胞受到自身免疫攻擊而選擇性地被破壞，胰島B細(xì)胞功能受損，胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足［3－5］。STZ是一種廣譜抗菌素，對(duì)大小鼠的胰腺B細(xì)胞具有選擇性毒性作用，可引起血糖升高及胰島萎縮等改變，但其發(fā)病機(jī)制及病理生理改變與人類糖尿病差別較大［6］。小劑量多次注射 STZ通過(guò)激活自身免疫過(guò)程導(dǎo)致B細(xì)胞損傷［7］，與 I型糖尿病的發(fā)病機(jī)理學(xué)說(shuō)類似。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，小劑量STZ作用于恒河猴胰腺18個(gè)月后，胰島B細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，胰島素表達(dá)降低，合成和分泌胰島素的功能減弱較正常動(dòng)物明顯減弱。從組織學(xué)上證實(shí)此模型與人類糖尿病的相似性。

嚙齒類動(dòng)物的胰腺中，A細(xì)胞占15% ～20%，B細(xì)胞占60% ～80%，D細(xì)胞少于10%，PP細(xì)胞不足1%［8］。而在人類胰島中，A、B、D、PP 四種細(xì)胞比例分別為20% ～25%，60% ～75%，5%和少于1%［9］。本實(shí)驗(yàn)中，恒河猴胰島 D細(xì)胞、PP細(xì)胞比例與嚙齒類相差不大，而B細(xì)胞比例減少，A細(xì)胞比例增多，其細(xì)胞比例與人類更接近。

生理情況下，A細(xì)胞分泌的高血糖素與B細(xì)胞分泌的胰島素相互拮抗和協(xié)調(diào)維持了血糖的穩(wěn)定。正常情況下胰島素作用占優(yōu)勢(shì)。胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足時(shí)，胰高血糖素作用加強(qiáng)而且可以直接作用于B細(xì)胞。反映在組織學(xué)上即表現(xiàn)為A細(xì)胞的增生和胰高血糖素的表達(dá)增加。胰島D細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)抑素是一種含14個(gè)氨基酸的肽類激素，可通過(guò)旁分泌發(fā)揮抑制糖吸收，調(diào)節(jié)糖代謝的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道給予外源性生長(zhǎng)抑素可預(yù)防STZ引起的胰島素分泌障礙［10］。胰島素分泌不足時(shí)，D細(xì)胞代償性增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示恒河猴胰島A細(xì)胞數(shù)量顯著增加，胰高血糖素表達(dá)增多(P＜0.01)。D細(xì)胞的數(shù)量級(jí)表達(dá)情況雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組相比仍有上升趨勢(shì)。與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

本文在使用STZ成功誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動(dòng)物模型后，利用免疫組化方法顯示恒河猴動(dòng)物模型胰島各種細(xì)胞的數(shù)量和激素表達(dá)情況，證實(shí)其數(shù)量及表達(dá)與人類糖尿病類似，為模型的應(yīng)用提供參考。

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