五種國產(chǎn)與進口小鼠病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較研究

王 吉，衛(wèi) 禮，付 瑞，李曉波，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，北京 100050)

國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，實驗小鼠病毒抗體檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫酶試驗(IEA)、免疫熒光試驗(IFA)、血凝試驗(HA)、血凝抑制試驗(HAI)、免疫組織化學(xué)試驗(IH)。但實驗室通常采取ELISA法作為主要檢測手段。作為國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，在承擔(dān)來自全國各省市送檢實驗動物質(zhì)量檢測任務(wù)的同時，還為實驗動物相關(guān)單位提供實驗動物病毒ELISA抗體檢測試劑盒。為提高ELISA法檢測的準(zhǔn)確性及可靠性，保證ELISA抗體檢測試劑盒的質(zhì)量，我們制備的淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠細(xì)小病毒(MPV)等5種病毒ELISA抗體檢測試劑盒與美國Charles River公司生產(chǎn)的試劑盒進行比較，客觀評價和分析了國產(chǎn)試劑與進口試劑的真實性及可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

國產(chǎn)小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、細(xì)小(MPV)病毒 ELISA抗體檢測試劑盒(批 號 分 別 為 090122、090129、090206、090207、090212):本室生產(chǎn);進口淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠細(xì)小病毒(MPV)ELISA抗體檢測試劑盒(批號分別為:LCM:His3(102808)T、MHV:17(070908)T、SV:Q(012808)P、MadV:F-10(11280F)Q、MPV:302(072808)U):美國 Charles River產(chǎn)品;小鼠血清:2010年國內(nèi)送檢的24份陰性血清和12份陽性血清。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀:Thermo Multiskan MK3;37℃水浴箱:上海森信實驗儀器有限公司 DK-4500B型;37℃培養(yǎng)箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 實驗操作及判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定:

1.3.1.1 實驗操作依據(jù)各自試劑盒說明書進行。

1.3.1.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

(1)國產(chǎn)試劑盒:在陰、陽對照成立的情況下:待檢血清特異抗原孔A值≥0.2;待檢血清特異抗原孔A值/陰性對照特異抗原孔A值≥2.1;特異抗原孔和正常抗原孔A值比值≥2.0時，判為陽性［1］。

(2)進口試劑盒:在陰陽對照成立的情況下(陰性對照特異抗原孔＜0.13，陽性對照特異抗原孔＞0.26):特異抗原孔和正?？乖瓕φ湛譇值均＜0.13，判為陰性;特異抗原孔和正?？乖瓕φ湛譇值均 ＞0.26，判為陽性;特異抗原孔 A值 ＞0.26，正?？乖瓕φ湛譇值 ＜0.26，用特異抗原孔A值減去正?？乖瓕φ湛譇值的差≥0.39時，判為陽性。

1.3.2 敏感性試驗:兩種試劑盒分別檢測國產(chǎn)、進口陽性血清。血清從1:40依次倍比稀釋到1:81920，進行檢測。按照2種試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)，最大稀釋比例的陽性孔為其檢測靈敏度［1，2］。

1.3.3 特異性試驗:用5種試劑盒分別檢測國內(nèi)和國外其他4種陽性血清，同時設(shè)陰、陽對照。觀察每種試劑盒與其他4種病毒有無交叉反應(yīng)［2］。

1.3.4 精密性試驗:同一批次試劑盒，測同一份陽性血清，同一稀釋度同時做20孔，計算檢測結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)［1］。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗:將同一批次抗原包被板于4℃放置30、90、180 d，同時檢測已知4份陰性和4份陽性血清，計算試劑盒檢測數(shù)值結(jié)果的變化率(相對偏差)，比較試劑盒的時間穩(wěn)定性［1，2］。

1.3.6 可信度:分別用國產(chǎn)和進口 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV抗體 ELISA檢測試劑盒，檢測已經(jīng)用商品化 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV IFA 抗體檢測試劑盒檢測過的各自相對應(yīng)的已知24份陰性血清和12份陽血清，驗證國產(chǎn)和進口ELISA試劑盒的可信度［1－4］。

1.3.7 統(tǒng)計方法:對實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行卡方(χ2)檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，均具有統(tǒng)計學(xué)意義［5，6］。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗

(1)國產(chǎn)和進口試劑盒檢測國產(chǎn)陽性血清

表1 敏感性實驗檢測結(jié)果1Tab．1 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．I．

從表1檢測結(jié)果看，國產(chǎn)和進口的MHV和SV試劑盒檢測靈敏度均很高，國產(chǎn)試劑盒是進口試劑盒的2倍，差異顯著(，P＜0.05);LCMV和 MPV檢測靈敏度國產(chǎn)試劑盒均是進口試劑盒的的8倍，差異極顯著(P＜0.01);MAV檢測靈敏度進口試劑盒是國產(chǎn)試劑盒的16倍，差異極顯著(P＜0.01)。

(2)國產(chǎn)和進口試劑盒同時檢測進口強陽性血清

表2 敏感性實驗檢測結(jié)果2Tab．2 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．II．

從表2檢測結(jié)果看，LCM、MPV試劑盒檢測靈敏度相同，均為1:80;國產(chǎn)和進口 MHV和 SV試劑盒檢測靈敏度均較高，進口試劑盒是國產(chǎn)試劑盒的2倍，差異顯著(P＜0.05);進口 MAV試劑盒檢測靈敏度是國產(chǎn)的16倍，差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 特異性試驗

每種試劑盒分別檢測國內(nèi)、國外其他5種病毒陽性血清，在陰、陽性對照均成立的情況下，對其他4種病毒陽性血清檢測，結(jié)果均為陰性，說明每種試劑盒與其他4種病毒均無交叉反應(yīng)。

2.3 精密性試驗

國內(nèi)外五種試劑盒精密性試驗結(jié)果(批內(nèi)平均變異系數(shù)%)見表3。

表3 精密性試驗結(jié)果(批內(nèi)變異系數(shù)%)Tab．3 Results of detection precision obtained with the domestic and imported ELISA kits(coefficient variations%)

國內(nèi)外5種試劑盒精密性試驗檢測結(jié)果顯示均小于10%。

2.4 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗檢測結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(相對偏差%)Tab．4 Results of detection stability obtained with the domestic and imported ELISA kits(Relative deviation，%)

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示五種國產(chǎn)試劑盒和進口試劑盒，測得的相對應(yīng)的8份血清的 A值變化率(相對偏差)均小于25%。

2.5 可信度

每種病毒抗體的24份陰性血清，使用國產(chǎn)和進口試劑盒檢測符合率均為100%，LCMV、MHV、SV、MPV 4種病毒抗體的12份陽性血清，使用國產(chǎn)和進口試劑盒檢測符合率均為100%，僅有國產(chǎn)MAV試劑盒檢測已知12份陽性血清，檢測符合率為86.1%(表 5)。

表5 ELISA方法檢測已知LCMV抗體陰、陽血清結(jié)果Tab．5 Detection results of known negative and positive sera samples with the domestic and imported ELISA kits

3 討論

敏感性試驗顯示，LCMV和MPV國產(chǎn)試劑盒檢測國產(chǎn)和進口陽性對照血清靈敏度分別為1∶640和1∶80，進口試劑盒檢測國產(chǎn)和進口陽性對照血清靈敏度均為1:80，說明 LCMV、MPV國產(chǎn)試劑盒檢測敏感性不比進口試劑盒低。MHV、SV國產(chǎn)與進口試劑盒檢測國內(nèi)陽性血清顯示靈敏度均很高(均達(dá)到1:2560以上)，且國產(chǎn)試劑盒高于進口試劑盒2倍;國產(chǎn)與進口試劑盒檢測進口陽性血清顯示靈敏度均較高(均達(dá)到1:320以上)，且進口試劑盒高于國產(chǎn)試劑盒2倍，說明國產(chǎn)MHV、SV試劑盒檢測敏感性與進口MHV、SV試劑盒檢測敏感性均較好，同時也說明了國產(chǎn)和進口試劑盒抗體檢測水平相當(dāng)［4，7］。

國產(chǎn)MAV試劑盒檢測國產(chǎn)和進口試劑盒陽性血清，靈敏度均很低，分別為 1∶80和 1∶40，且檢測國產(chǎn)陽性對照血清 A值最高只有0.461，檢測進口陽性對照血清，A值最高只有0.304。而用進口試劑盒檢測國產(chǎn)和進口試劑盒的陽性對照血清靈敏度均達(dá)到1:1280，且檢測的 A值均很高，進口試劑盒檢測國內(nèi)MAV陽性對照血清A值最高達(dá)到1.153，進口試劑盒檢測進口陽性對照血清最高達(dá)到0.972。這說明我們的試劑盒抗原包被板抗原性很低，導(dǎo)致抗原抗體結(jié)合反應(yīng)能力降低，使試劑盒檢測敏感性下降，即抗體檢測水平下降［4，7］。同時通過此次試劑盒比對實驗也使我們找到了近2年來檢測過程中發(fā)現(xiàn)MAV陽性對照血清A值下降的原因。國產(chǎn)試劑盒用的檢測抗原是經(jīng)過蔗糖梯度純化的全病毒抗原，而病毒是用細(xì)胞來進行傳代培養(yǎng)，也就是我們在傳代培養(yǎng)MAV過程中，可能是由于細(xì)胞毒性導(dǎo)致了培養(yǎng)細(xì)胞病變，誤認(rèn)為是病毒導(dǎo)致細(xì)胞病變，而且一代一代傳下去，而導(dǎo)致病毒抗原性下降。本實驗室通過分子生物學(xué)檢測也證實了這一點。用PCR方法對本室傳代的MAV進行檢測時，檢測結(jié)果為陰性，而用同一PCR方法檢測從美國ATCC新購的MAV(編號VR-550)傳代培養(yǎng)的P3代細(xì)胞毒，檢測結(jié)果為陽性。

但MAV試劑盒的陽性對照血清抗體效價很高，可能與檢測用抗原(批號:080624)和免疫用抗原(批號:030322)不是同一批號有關(guān)，且通過此實驗證明國產(chǎn)MAV試劑盒陽性對照血清抗體效價還很高，說明當(dāng)時用于制備抗血清用的免疫用抗原(批號:080624)的抗原性還沒有下降，而用于檢測用包被抗原(批號:080624)抗原性已經(jīng)下降。

在試劑盒顯色劑使用方面，進口試劑盒使用ABTS(2，2'-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，國產(chǎn)試劑盒使用 OPD作為 ELISA顯色劑，雖然敏感、特異，但由于OPD(鄰苯二胺)具有揮發(fā)和致突變效應(yīng)，所以國內(nèi)試劑盒顯色劑需要進行改進。

通過此次比對實驗不但使我們找到了國產(chǎn)MAV試劑檢測盒敏感性下降的原因，也提示我們，實驗室原有的病毒傳代培養(yǎng)方式，可能有的病毒不能適應(yīng)，所以為了保證和提高檢測試劑的質(zhì)量，有些病毒的傳代培養(yǎng)方式需要更新或改變。同時也說明除 MAV試劑盒外，與進口試劑盒比，國產(chǎn)LCM、MHV、SV、MPV試劑盒在敏感性、特異性、精密性、穩(wěn)定性及可信度方面均較好，而且通過在2010和2011年“實驗動物質(zhì)量檢測機構(gòu)比對實驗”中，用國產(chǎn)小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙臺(SV)ELISA抗體檢測試劑盒的進行不同人員及不同實驗室的比對實驗，也證明了國產(chǎn)小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙臺(SV)ELISA抗體檢測試劑盒的質(zhì)量可靠，穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較好。

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