艾厚喜，左瑋,，王曉鋒，張麗，季暉，陳乃宏，王文

心腦血管疾病發(fā)病率在日益提高，給社會(huì)和國(guó)家?guī)?lái)巨大負(fù)擔(dān)，抗血小板聚集藥物在防治心腦血管疾病過(guò)程中起著重要作用。20世紀(jì)50年代以后，采用活血化瘀法治療心腦血管疾病等取得引人注目的進(jìn)展。研究活血化瘀中藥的活性成分，進(jìn)而開發(fā)出新藥，是中藥現(xiàn)代化研究的課題。

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)是山茱萸科植物，性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的作用。環(huán)烯醚萜苷是本室研究得到的山茱萸有效成分。對(duì)山茱萸環(huán)烯醚萜苷進(jìn)一步分離，得到莫諾苷(morroniside)。前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有抗氧化、抗凋亡等保護(hù)作用[1-4]；莫諾苷能減小大鼠局灶性腦缺血再灌注模型腦梗死體積[5]，抑制皮層脂質(zhì)過(guò)氧化作用[6]。此外，莫諾苷能顯著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)誘導(dǎo)的兔血小板聚集的作用，尤其對(duì)ADP的抑制作用選擇性強(qiáng)[7]。血小板聚集和胞漿中游離Ca2+濃度的升高密切相關(guān)。本文通過(guò)體外研究莫諾苷在ADP誘導(dǎo)血小板聚集后對(duì)Ca2+含量的影響，進(jìn)一步從分子角度探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備，高效液相分析，純度約98.5%。乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid,ASA)為SIGMA公司產(chǎn)品，用時(shí)用蒸餾水溶解，以0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0左右，再加蒸餾水稀釋到所需濃度。

1.2 試劑 ADP：SIGMA公司，配制成7.5 mg/ml儲(chǔ)存液，分裝，-20℃密封保存，臨用前稀釋，終濃度為10 μmol/L；Fura-2 AM：美國(guó)Quantikine公司。

1.3 動(dòng)物及儀器 新西蘭大耳白兔：體重(3.0±0.5)kg，SPF級(jí)，由北京開源兔業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)SCXK(京)2006-0005；SC-2000 Microfuge低溫離心機(jī)：美國(guó)BECK-MAN公司；IMT22型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(LP400型)：法國(guó)Diagnostic Pasteur。

1.4 方法

1.4.1 血小板的制備[8]取新西蘭大耳白兔，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉，固定于兔臺(tái)上，頸總動(dòng)脈插管取血，與3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑按9∶1(V/V)混勻。230 g離心10 min后取上清液即富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)，再將PRP 800 g離心15 min，得沉淀即血小板。

1.4.2 負(fù)載血小板懸液的制備 血小板經(jīng)無(wú)鈣Hepes buffer輕輕洗滌2次，然后用無(wú)鈣Hepes buffer重懸，調(diào)血小板的密度為(400～500)×109/L；加入終濃度2μM的Fura-2 AM，37℃恒溫避光振搖負(fù)載1 h。

1.4.3 血小板Ca2+的測(cè)定 經(jīng)500 g離心負(fù)載血小板懸液，取沉淀用無(wú)鈣Hepes buffer輕輕洗滌2次，去除多余的Fura-2 AM；再用無(wú)鈣Hepes buffer重懸，加入含鈣Hepes buffer，使其Ca2+終濃度為1 mmol/L。然后加入各組藥品溶液，莫諾苷低、中、高劑量組分別3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml，空白對(duì)照組生理鹽水，ASA組0.5 mg/ml。體外作用5 min；再加入ADP(終濃度為10μM)誘導(dǎo)聚集。雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)上作熒光測(cè)定，固定發(fā)射波長(zhǎng)于510 nm，采用改變波長(zhǎng)的時(shí)間掃描，激發(fā)波長(zhǎng)分別固定在340 nm和380 nm，記錄5 min內(nèi)Fura-2在激發(fā)波長(zhǎng)340 nm和380 nm處的熒光強(qiáng)度比值，即F340/F380值[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以(±s)表示。應(yīng)用一般線性模型(general linear model,GLM)的重復(fù)測(cè)量和多變量過(guò)程對(duì)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析和多元方差分析，并進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)和不同組間的兩兩比較。藥物對(duì)Ca2+濃度變化的影響用F340/F380比值對(duì)時(shí)間變化表示。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 球形檢驗(yàn) Mauchly球形檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.05，說(shuō)明重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)之間實(shí)際上不存在相關(guān)性，資料滿足Huynh-Feldt條件，可以用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的單變量方差分析處理資料。見表1。

2.2 分析時(shí)間、分組因素的作用以及時(shí)間和分組之間的交互作用 個(gè)體內(nèi)變異部分的計(jì)算結(jié)果顯示，時(shí)間因素對(duì)Ca2+濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明Ca2+濃度有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)；時(shí)間和分組的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明時(shí)間因素的作用隨著分組的不同而不同。個(gè)體間變異部分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明分組因素起作用。見表2。

表1 Mauchly球形檢驗(yàn)結(jié)果

表2 主體內(nèi)效應(yīng)的檢驗(yàn)

2.3 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上5個(gè)分組之間的兩兩比較 對(duì)1～5 min內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的F340/F380比值進(jìn)行兩兩比較。與空白對(duì)照組相比，在1～5 min內(nèi)ASA均能顯著降低由ADP誘導(dǎo)血小板聚集引起的F340/F380比值的升高(P＜0.001)。莫諾苷的低、中、高劑量組均能降低ADP誘導(dǎo)血小板聚集引起的F340/F380比值升高，并且具有濃度依賴性，其中中、高劑量組比ASA組的作用還強(qiáng)。說(shuō)明莫諾苷可以顯著降低ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后Ca2+濃度的升高(P＜0.001)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組F340/F380值比較

3 討論

血小板聚集和胞漿中游離Ca2+濃度的升高密切相關(guān)。Ca2+是血小板聚集和釋放反應(yīng)中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為活化信息的傳遞者通過(guò)活化磷脂酶A2作用于磷脂產(chǎn)生血小板活化的主要介質(zhì)如血栓烷等[10-11]。靜息的血小板胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度為100 nmol/L，在刺激劑的作用下其濃度可增1000 nmol/L以上。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高可引起血小板變形、分泌和聚集。Ca2+可通過(guò)很多途徑如Ca2+-降鈣素依賴性蛋白激酶、Ca2+依賴性蛋白激酶PLC、PLA和PKC激活血小板[12]。

本文著重通過(guò)測(cè)定莫諾苷是否能夠抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集后引起的Ca2+的上升，探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，莫諾苷可以不同程度抑制ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后Ca2+的上升。從分子機(jī)制證明莫諾苷可能通過(guò)這一機(jī)制，發(fā)揮兔體外抗血小板聚集的作用。但是體內(nèi)抗凝機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多種因素，因此對(duì)于莫諾苷抗凝機(jī)制還有待于進(jìn)一步做更詳盡的研究。

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