Notch1受體和配體分子Jagged1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及意義

劉 虹，李 建

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.長沙市中心醫(yī)院 B超室，湖南 長沙 410008）

Notch信號通路存在于許多動物體內(nèi)，Notch信號通路作為一種進(jìn)化保守的細(xì)胞間相互作用機(jī)制，影響細(xì)胞分化發(fā)育及凋亡。目前在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)4個同源體Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。其中Notch1不僅對正常細(xì)胞分化起重要作用，而且與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Notch1在腫瘤中有截然相反的兩種作用，至于其是癌基因還是抑癌基因。目前尚存爭議。Notch1信號通路是許多重要細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，對Notch1的研究可進(jìn)一步闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制，為腫瘤的基因治療及新藥開發(fā)提供一個新的有希望的靶點(diǎn)。但是，目前尚未見國內(nèi)外研究Notch1與肝癌中作用的報(bào)道少見。因此，本研究擬通過檢測Notch1、Jagged1在肝癌組中的表達(dá)，初步探討肝癌組織中Notch1、Jagged1的表達(dá)與肝癌細(xì)胞分化程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2010年1月～2011年1月經(jīng)病理檢查證實(shí)的肝癌樣本150例和及其相應(yīng)癌旁正常組織。其中，男98例，女52例，年齡32～72歲，中位年齡52歲。術(shù)前均未接受過非甾體類抗炎藥治療及放、化療。標(biāo)本取出后立即以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片備用。臨床與病理證實(shí)均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，腫瘤分化程度根據(jù)Edmondson四級分級法.將HCC分為I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級。

1.2 主要試劑

Notchl抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國Neomarker公司，clone A6），工作濃度為 1∶50；Jagged1抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國Santa-cruz公司，sc8303），工作濃度為1∶50，SP免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛液固定，常規(guī)處理，石蠟包埋，連續(xù)切片厚4μm。采用免疫組化SP法：石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；微波抗原修復(fù)；10%正常山羊血清封閉，室溫孵育15min，傾去血清，分別滴加Notch1、Jagged1一抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗。5min×3次：滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育20～30min，PBS沖洗，5min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素.37℃孵育 20～30min，PBS沖洗，5min×3 次；DAB顯色；自來水充分沖洗、復(fù)染、封片。實(shí)驗(yàn)中同時設(shè)陽性和陰性對照。

1.4 染色結(jié)果判斷

Notch1和Jagged1陽性染色定位于胞漿。參照CARCANGIU等[2]的半定量評分方法。根據(jù)陽性細(xì)胞著色程度和陽性細(xì)胞數(shù)量判斷結(jié)果。細(xì)胞陽性著色程度按無色、淡棕黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為0、1、2、3 分，陽性細(xì)胞數(shù)量按 ＜5%、5%～35%、36%～70%、＞70%分別計(jì)為 0、1、2、3 分，然后根據(jù)兩項(xiàng)評分相乘之積判斷結(jié)果≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），≥6分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行等級資料的秩和檢驗(yàn)和等級相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Notch1受體和配體分子Jagged1在肝癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，肝癌組織中Notch1及Jagged1分子主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿（附圖）。由表1可見，Notch1受體分子和配體Jagged1分子在肝癌和癌旁正常組織中均有不同程度的表達(dá)，在肝癌和癌旁正常組織中，Notch1的陽性表達(dá)率分別為16.4%和 91.3%；Jagged1的陽性表達(dá)率分別為10.9%和85.7%，兩組間差異均有顯著性（P=0.000）。

表1 Notchl、Jaggedl蛋白在肝癌、癌旁正常肝組織中的表達(dá)

附圖 Notch1和Jagged1免疫組化檢測結(jié)果[通用型兩步（400×）]

2.2 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)與患者性別及年齡的關(guān)系

2.2.2 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá)與病理特征的關(guān)系 表3可見，Notch1分子的表達(dá)與肝癌組織學(xué)分級、Edmondson分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。表4可見，Jagged1分子在肝癌不同分化級別間差異顯著，中高分化組肝癌Jagged1表達(dá)（82.9%）顯著低于低分化組（100.0%，P＜0.05）；分化程度越低，Jagged1的表達(dá)越高，兩者呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.392，P=0.002）；不同 Edmondson 分期間Jagged1 表達(dá)差 異也顯著 ，Edmondson（I+II）期Jagged1表達(dá)（78.3%）顯著低于 Edmondson（III+IV）期（96.4%，P＜0.05）；從 Edmondson I期到 IV期，表達(dá)逐漸增高，兩者呈正相關(guān)（rs=0.276，P=0.001）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Jagged1的表達(dá)（97.1%）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（73.3%，P＜0.05），且兩者之間也呈正相關(guān)（rs=0.252，P=0.006）。

表2 肝癌中Notch1及Jagged1蛋白表達(dá)與與患者性別、年齡及腫瘤大小之間的關(guān)系

表3 肝癌組織中Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系

2.2.3 肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達(dá)的關(guān)系由表4可見，肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.247，P=0.007）。

表4 肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達(dá)的關(guān)系

3 討論

Notch信號是細(xì)胞與細(xì)胞之間直接作用的主要信號通路之一，對多細(xì)胞生物中細(xì)胞命運(yùn)的決定起關(guān)鍵作。在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)4類Notch基因，編碼4種Notch受體，分別為Notchl1-4。Notch受體是一種跨膜受體，成熟的Notch受體分子是由胞外域和跨膜區(qū)/胞內(nèi)域2個亞基組成的異三聚體。Notch胞外區(qū)與其配體結(jié)合后調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用并進(jìn)而激活Notch，經(jīng)3次裂解后產(chǎn)生NICDN，此為Notch受體的活化形式。

1991年，Notch1與腫瘤的關(guān)系首先在人類T淋巴母細(xì)胞白血病中被確定[1]隨后的研究發(fā)現(xiàn)，染色體易位 t（7；9）（q34；q34.3） 使位于 9 號染色體上的Notch1基因斷裂，導(dǎo)致Notch1胞外區(qū)丟失，其胞內(nèi)區(qū)獲得組成性活性而呈現(xiàn)致癌作用。但Notch信號與腫瘤的關(guān)系極其復(fù)雜，在不同狀況下，分別充當(dāng)癌基因或抑癌基因的作用。如TONON等[2]闡述了Notch在黏液表皮樣癌中作為癌基因在信號通路中的作用，而NICOLAS等[3]則發(fā)現(xiàn)在鼠皮膚癌發(fā)生中，Notch1起抑癌作用而不是促癌作用。在不同組織、腫瘤發(fā)展的不同階段，Notch的作用也可能不同。ZAGOURAS等[4]實(shí)驗(yàn)顯示，從正常宮頸組織到宮頸上皮內(nèi)瘤變，再到早期分化好的宮頸癌，Notch1的表達(dá)量逐漸增高，其定位由胞質(zhì)至胞核，而晚期宮頸癌Notch1表達(dá)水平顯著下降，提示Notch1在宮頸癌發(fā)生早期階段為促癌作用，而晚期表現(xiàn)為抑癌作用。COLLINS等[5]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中Notch1和Notch2呈高表達(dá)，在小細(xì)胞肺癌（SCLC）中卻很少能檢測到Notch1表達(dá)，Notch2也只偶有表達(dá)。Notch1信號激活對NSCLC是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，對SCLC則抑制腫瘤細(xì)胞生長。

人的Notch配體包括Delta1、Delta3、Delta4、Jaggedl和Jagged2五種。Jagged1是Notch受體的主要配體之一，參與調(diào)控許多組織的生長發(fā)育，對正常造血前體細(xì)胞的維持及其增殖的調(diào)控起著重要作用。Jagged1通過與鄰近細(xì)胞表面Notch受體的胞外域結(jié)合而觸發(fā)Notch信號通路，通過HES-1，Deltex和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。DICKSON等[6]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Notch1和Jagged1表達(dá)增強(qiáng)，并與惡性腫瘤侵襲性增強(qiáng)、預(yù)后不良有顯著關(guān)系，其十年生存率及中位生存期明顯降低。配體Jagged1蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移者及前列腺良性組織，提示Jagged1與前列腺癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)。

本研究顯示，Notch1蛋白在肝癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，與CHU等[7]的研究結(jié)果相符；本研究表明肝癌組織中Jagged1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，且Notch1蛋白與Jagged1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。說明Notch1信號也參與了肝癌的致病過程。本研究還表明肝癌中Notch1及Jagged1蛋白的表達(dá)與患者性別與年齡，腫瘤的部位與大小均無關(guān)；但Jagged1蛋白的表達(dá)與大腸癌的分化程度有關(guān)，中高分化大腸癌Jagged1蛋白的表達(dá)顯著低于低分化大腸癌，且兩者呈負(fù)相關(guān)：不同Edmondson分期間Jagged1表達(dá)差異也顯著，Jagged1 表達(dá)在 Edmondson（I+II）期患者中低于Edmondsons（III+IV）期，兩者呈正相關(guān)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Jagged1的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，也呈正相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果進(jìn)一步提示Jagged1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。因?yàn)槟[瘤組織學(xué)分級、Edmondsons分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與預(yù)后密切相關(guān)。因此，肝癌組織中Jagged1蛋白的表達(dá)可能作為預(yù)測肝癌預(yù)后的一個指標(biāo)，有待進(jìn)一步隨訪研究。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)：肝癌組織中Notch1受體及其相關(guān)配體Jagged1的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且后者與肝癌分化程度、Edmondson分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示Notch信號在肝癌致病過程中起促癌作用。Jagged1在促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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