林 妲 彭 紅 阮榕生 余紫蘋 劉玉環(huán)

(南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程技術(shù)研究中心，江西南昌，330047)

一種快速測定毛竹半纖維素中糖醛酸含量的方法

林 妲 彭 紅 阮榕生 余紫蘋 劉玉環(huán)

(南昌大學(xué)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程技術(shù)研究中心，江西南昌，330047)

采用間羥基聯(lián)苯比色法測定毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸含量，并研究了四硼酸鈉/硫酸、間羥基聯(lián)苯溶液添加量及沸水浴時(shí)間對測定結(jié)果的影響，建立了適合于毛竹半纖維素中糖醛酸含量的測定條件，同時(shí)證明了該方法測定毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和精密度。

毛竹半纖維素;葡萄糖醛酸;間羥基聯(lián)苯比色法

毛竹又名“楠竹”、“孟宗竹”，禾本科竹亞科剛竹屬，單軸散生型，常綠喬木狀竹類植物。毛竹面積占我國竹林總面積的70%，其生長速度快、繁殖能力強(qiáng)、生態(tài)功能顯著，在可再生資源中占有重要地位［1］。毛竹作為一種可再生天然資源被廣泛應(yīng)用于食品、造紙、化學(xué)、制藥等行業(yè)中，其半纖維素含量約為20% ～35%［2］，所以分離毛竹半纖維素并深入研究其結(jié)構(gòu)是開發(fā)毛竹資源、提高毛竹半纖維素資源附加值的前提條件。

毛竹作為禾本科植物，其半纖維素為聚木糖類半纖維素，主要是聚阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木糖。即以 (1→4)-β-D-聚木糖為主鏈，阿拉伯糖和4-O-甲基-α-D-葡糖醛酸或D-葡萄糖醛酸作為側(cè)鏈分別以C-3位和 C-2位與主鏈相連［3］，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

由于葡萄糖醛酸是毛竹半纖維素支鏈的重要組成部分，其含量在一定程度上反應(yīng)了提取條件是否會(huì)破壞毛竹半纖維素結(jié)構(gòu)，因此，檢測毛竹半纖維素中的葡萄糖醛酸含量成為重要的檢測指標(biāo)之一。常用的糖醛酸含量測定方法有硫酸-咔唑法、間羥基聯(lián)苯比色法、離子色譜法、氣相分析和液相分析法等，前兩者較為常用。但是由于天然產(chǎn)物中的中性己糖和戊糖對咔唑造成干擾，會(huì)影響糖醛酸含量測定的準(zhǔn)確性。比較而言，間羥基聯(lián)苯比色法更為快速、簡便，也更精確［5］。因此本實(shí)驗(yàn)采用間羥基聯(lián)苯比色法測定毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸含量，并考察最佳測定條件，以期找到測定毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸含量的最佳測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

主要儀器與設(shè)備:UV9100型紫外-可見分光光度計(jì) (北京萊博泰科儀器有限公司);DHG-9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司);TDL-5000B型大容量離心機(jī) (上海安亭儀器廠);Sartorius電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司);SK200H超聲處理器 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

圖1 聚木糖類半纖維素結(jié)構(gòu)式

試劑及材料:本實(shí)驗(yàn)所選取的毛竹原料取自南昌梅嶺官溪村當(dāng)?shù)靥烊恢窳?，曬干后切成小片?jīng)粉碎，收集40～100目篩粉末備用。無水乙醇，95%乙醇，乙酸，甲苯，氫氧化鈉，硫酸，葡萄糖醛酸，間羥基聯(lián)苯，四硼酸鈉，均為分析純;亞氯酸鈉為化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備毛竹半纖維素樣品

毛竹半纖維素為實(shí)驗(yàn)室自制，采用堿分級分離方法［6］。毛竹樣品經(jīng)索氏抽提脫除蠟質(zhì)和色素等雜質(zhì)再經(jīng)亞氯酸鈉、冰醋酸脫木素后得到毛竹綜纖維素。綜纖維素按固液比1∶20在2%NaOH［7-8］溶液中55℃下抽提2.5 h后用冰醋酸中和至pH值為5.5，再經(jīng)4800 r/min離心20 min，收集沉淀即為半纖維素A組分，標(biāo)記為AH1。濃縮上清液，經(jīng)3倍體積95%乙醇沉淀過夜，收集沉淀并經(jīng)70%乙醇洗滌，得到半纖維素B組分，標(biāo)記為BH1。剩余殘留物繼續(xù)經(jīng)過5%NaOH抽提，過程同上，得到半纖維素A組分，標(biāo)記為AH2，半纖維素B組分，標(biāo)記為BH2。

1.2.2 配制對照品溶液

(1)葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取干燥至恒重的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品25.00 mg，加水溶解并定容至25 mL，混勻，制備成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

(2)四硼酸鈉/硫酸溶液:準(zhǔn)確稱取0.478 g四硼酸鈉溶解于100 mL濃硫酸中，備用。

(3)間羥基聯(lián)苯溶液:準(zhǔn)確稱取0.15 g間羥基聯(lián)苯溶解于5 mg/mL氫氧化鈉溶液中，定容至100 mL，其質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，暗處保存，保持4℃條件下放置1個(gè)月以上備用［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件選擇

2.1.1 最大吸收波長采用葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成0.05 mg/mL葡萄糖醛酸溶液，置于具塞試管中，加入四硼酸鈉/硫酸溶液5 mL，振蕩使其混合均勻，再沸水浴5 min，冰水浴冷卻后加入間羥基聯(lián)苯溶液100 μL，振蕩混合均勻，使用超聲儀脫氣，蒸餾水作為對照，在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長為524 nm。

2.1.2 四硼酸鈉/硫酸溶液用量

熱的濃硫酸可有效降解多聚糖，毛竹半纖維素為聚阿拉伯糖木糖，在熱濃硫酸作用下可降解成為單糖，同時(shí)釋放出葡萄糖醛酸單體，四硼酸鈉增加了葡萄糖醛酸在間羥基聯(lián)苯作用下顯色的敏感性。故四硼酸鈉/硫酸溶液的用量對測定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響。本實(shí)驗(yàn)在1 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同量四硼酸鈉/硫酸溶液，再加入100 μL間羥基聯(lián)苯溶液，沸水浴5 min，在此條件下測定吸光度，以蒸餾水作為空白對照樣。結(jié)果見表1。

表1 不同用量四硼酸鈉/硫酸溶液測得吸光度值

由表1可知，隨四硼酸鈉/硫酸溶液用量的增加，混合反應(yīng)體系吸光度先增高然后降低，其吸光度最大值對應(yīng)的四硼酸鈉/硫酸溶液用量為5 mL。因此，四硼酸鈉/硫酸溶液最佳用量為5 mL。

2.1.3 間羥基聯(lián)苯溶液用量

經(jīng)水解的葡萄糖醛酸可與間羥基聯(lián)苯溶液發(fā)生顯色反應(yīng)，生成紫紅色透明溶液，為考察間羥基聯(lián)苯用量對毛竹半纖維素糖醛酸含量測定結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)在1 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同量間羥基聯(lián)苯溶液，再加入5 mL四硼酸鈉/硫酸溶液，沸水浴5 min，在此條件下測定吸光度，以蒸餾水作為空白對照樣。測定結(jié)果見表2。

由表2數(shù)據(jù)可知，吸光度最大時(shí)對應(yīng)的間羥基聯(lián)苯溶液用量為120 μL，因此確定間羥基聯(lián)苯最佳用量為 120 μL。

表2 不同用量間羥基聯(lián)苯溶液測得的吸光度值

表3 不同沸水浴時(shí)間下測得的吸光度值

2.1.4 沸水浴時(shí)間

由于多糖在硫酸中的水解需要在加熱條件下進(jìn)行，因此，加熱時(shí)間會(huì)影響水解程度進(jìn)而影響反應(yīng)體系的吸光度，最終對測定結(jié)果造成影響。本實(shí)驗(yàn)取1 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在不同沸水浴時(shí)間條件下，加入5 mL四硼酸鈉/硫酸溶液、120 μL間羥基聯(lián)苯溶液，測定吸光度，以蒸餾水作為空白對照。測定結(jié)果見表3。

由表3可知，沸水浴加熱3 min后吸光度較穩(wěn)定，隨加熱時(shí)間的延長吸光度緩慢地增長，6 min時(shí)達(dá)到最大值，之后吸光度有所下降，加熱10 min后吸光度再次回升，表明加熱時(shí)間太長可能影響吸光度的穩(wěn)定性，因此選擇沸水浴加熱時(shí)間為6 min。

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為實(shí)驗(yàn)對象，蒸餾水作空白對照，每隔20 min測定吸光度，以檢測該方法的穩(wěn)定性，結(jié)果如表4所示。

由表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在2 h之內(nèi)，吸光度比較穩(wěn)定，同時(shí)可知該方法對測量時(shí)間要求不高，因此對操作人員技術(shù)要求不高，方法簡單易行。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為實(shí)驗(yàn)對象，選取最佳實(shí)驗(yàn)條件 (具體操作見2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制)，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，重復(fù)8次進(jìn)行吸光度測定，由吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算得RSD=3.34%，小于5%，說明該方法精密度較好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表5所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取1.00 mg/mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，定容后分別取上述各溶液1 mL置于具塞試管中。加入四硼酸鈉/硫酸溶液5 mL，振蕩使其混合均勻，于沸水浴中加熱6 min后冰水浴冷卻。加入1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液120 μL，振蕩混勻后超聲除去氣泡，以蒸餾水作為空白對照樣。在524 nm波長處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并擬合求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=11.5222x+0.0259(R2=0.9995)。

圖2 葡萄糖醛酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

表5 精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

2.5 樣品中糖醛酸含量測定

稱取 AH1、AH2和 BH1、BH2樣品各0.05 g，配置成為0.05 mg/mL溶液，按2.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線操作。毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ρ樣為按標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的樣品中葡萄糖醛酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)，D為稀釋因素 (mL)，W樣為樣品質(zhì)量 (mg)。

表6 毛竹半纖維素葡萄糖醛酸吸光度及含量

2.6 毛竹半纖維素中糖醛酸含量測定值

按照2.5測定方法測定毛竹半纖維素中糖醛酸含量，以1 mL蒸餾水做空白對照，重復(fù)做3次，測定吸光度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其中糖醛酸含量平均值，結(jié)果見表6。

表7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

根據(jù)表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，毛竹半纖維素A中葡萄糖醛酸含量低于毛竹半纖維素B中葡萄糖醛酸含量。

另以自制毛竹半纖維素BH1溶液為實(shí)驗(yàn)對象，選取最佳實(shí)驗(yàn)條件，同樣測定方法進(jìn)行操作，測量樣品吸光度，并重復(fù)8次，根據(jù)吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算得RSD=2.5%，RSD小于5%，說明該方法重復(fù)性較好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)證明間羥基聯(lián)苯法能夠有效測定堿分級分離提取得到的毛竹半纖維素中葡萄糖醛酸含量，該方法重現(xiàn)性好，精密度高，操作簡便、易行。其最佳反應(yīng)條件為四硼酸鈉/硫酸溶液用量為5 mL，間羥基聯(lián)苯溶液用量為120 μL，沸水浴時(shí)間為6 min，顯色反應(yīng)完成后2 h內(nèi)吸光度變化不大。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)可知，分級分離提取的毛竹半纖維素A較半纖維素B葡萄糖醛酸含量更高。

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A Quick Method for Quantitative Determination of Uronic Acid in Hemicellulose of Moso Bamboo

LIN Da*PENG Hong RUAN Rong-sheng YU Zi-ping LIU Yu-huan
(The Engineering Research Center for Biomass Conversion，MOE，Nanchang，Jiangxi Province，330047)

Arabinoglucuronoxylan is the main component in the hemicellulose of moso bamboo．The content of glucuronic acid which is as the main side chain can reflect the structure of the hemicellulose．In this paper，a method for the determination of glucuronic acid in hemicellulose of moso bamboo with m-hydroxydiphenyl was used．The amounts of tetraborate/H2SO4，m-hydroxydiphenyl and the boiling time were studied．This method was proved simple，accurate and reproducible．

hemicellulose;moso bamboo;glucuronic acid;method of m-hydroxydiphenyl

TS749+.3

A

0254-508X(2012)03-0016-04

林 妲女士，在讀碩士研究生;研究方向:生物質(zhì)能源。

(E-mail:lindatt2008@yeah．net)

2011-12-04(修改稿)

本課題得到國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (30960304)資助。

(責(zé)任編輯:趙旸宇)