HBV感染恢復期血清標志物與肝細胞HBV cccDNA檢測對照*

宋閩寧 黃文琪 閔 峰 洪美珠 范榮華 吳衛(wèi)兵 張 麗 李偉杰

1.廈門大學附屬成功醫(yī)院感染科/中國人民解放軍第174醫(yī)院感染科 (福建廈門，361003)

2.中國人民解放軍第302醫(yī)院

慢性乙型肝炎 (CHB)抗病毒治療是目前的主要治療手段，作為主要抗HBV的核苷類由于有停藥時間不易確定的不利因素，臨床難以操作。為了解掌握理想的停藥時機，將CHB患者不同血清學狀況與肝組織HBV cccDNA進行檢測對照，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 39例患者均為2008年4月至2010年4月在廈門大學附屬成功醫(yī)院就診的住院及門診患者。女9例，男30例，年齡平均56.2歲。其中13例為既往HBV感染自然恢復者，13例為乙型肝炎肝硬化肝癌患者，13例為CHB患者。診斷符合2010年中華醫(yī)學會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準［1］，39例中的26例乙型肝炎肝硬化肝癌或CHB患者，正在接受抗病毒治療的9例，曾接受抗病毒治療3例，14例未接受抗病毒治療。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標 住院患者于入院第二天收集患者血清標本做以下檢測:HBV DNA用熒光定量PCR方法檢測，試劑由達安公司提供。靈敏度為1000拷貝/ml。美國PE7000實時熒光擴增儀，低于1000拷貝/ml為檢測值陰性統(tǒng)計。HBV-M檢測試劑由新創(chuàng)公司提供。肝生化檢測用美國全自動生化檢測儀及配套試劑完成。CHB患者行肝臟穿刺組織活檢。HBV感染自然恢復者及乙型肝炎肝硬化肝癌患者肝組織取自手術標本。

病理檢查由我院病理科完成。

1.2.2 HBVcccDNA檢測方法:①石蠟包埋組織切片HBV DNA的提取:甲醛固定石蠟包埋 (FFPE)組織切片時，嚴格防止交叉污染。經二甲苯及梯度酒精脫蠟后，通過試劑盒提取DNA，操作嚴格按照說明書進行。提取DNA儲存于-20℃冰箱中備用。用試劑盒提取血清DNA儲存于-20℃冰箱中備用。②PSAD酶消化:按照說明所述該酶所需環(huán)境及溫度，設定反應體系為樣品 DNA8.3μl，PSAD酶0.2μl，ATP solution 0.5ul，buffer1ul。反應條件為37℃30分鐘，70℃滅酶活性30分鐘。③滾環(huán)擴增 (Rolling circular amplification，RCA)反應:根據我國常見的HBV基因型B，C基因組全序列，設計引物共四對。反應體系與循環(huán)條件參照文獻進行。跨缺口熒光定量PCR采用Taqman探針real-timePCR法，根據cccDNA結構特性，設計跨HBV缺口上下游引物Pup82，Pdown83和探針1，擴增長度為236bp，擴增產物為cccDNA。同時設計內參beta-actin的ta-up 3引物be，beta-down3和探針3，擴增內參 beta-actin基因。檢測所需模板用量為 3μl，dNTP5μl，MgCl2，3.5μl，PCR buffer 2.5μl，相 應 引 物 及 Taq 酶 各0.5μl，剩余體積用雙蒸水補足，總體系為25μl。反應時間僅1小時20分鐘。標準曲線由自行構建的已知濃度的質粒DNA梯度稀釋后建立。進行梯度稀釋鑒定該方法的靈敏度，并對該方法進行批內和批間重復性檢測。定量測出β-actin的量，除以6.667(單個肝細胞中所含有的β-actin量)，最后得出每個肝細胞中所含有的HBV cccDNA拷貝數。以檢出單個肝細胞中所含有HBV cccDNA拷貝數為陽性。實驗由中國人民解放軍302醫(yī)院肝炎中心完成。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包分析，率的比較用卡方檢驗或Fisher's精確概率法;計量資料以表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組HBV血清標志物檢測結果與肝細胞HBVcccDNA結果對照 見表1。將乙型肝炎肝硬化肝癌、CHB及既往HBV感染各組HBV血清標志物 (HBV-M)相對照;結果顯示肝癌及CHB患者e抗體陽性分別為12/13例:9/13例，血HBV DNA陽性分別為6/13例:8/13例，但肝細胞HBVcccDNA均檢出陽性 (100%)。既往乙肝病毒感染13例中，HBsAg陰性，抗HBs及/或抗HBc陽性各7和6中，仍有3例 (23%)肝細胞中HBVcccDNA陽性。與另兩組對照，χ2等于5.5(P＜0.01)。具顯著差異。

表1 3組患者血清HBV-M與肝組織HBV cccDNA比較［%(n)］

2.2 血清HBV-M與肝臟HBV cccDNA總量與細胞定量比較見表2。將既往HBV感染患者血清標志物存在狀況與肝組織HBV cccDNA定量對比，抗-HBs陽性組7例，肝組織HBV cccDNA總量102拷貝/ml，低于抗-HBe陽性及抗-HBs陽性組的106拷貝/ml和105拷貝/ml，t=3.7、3.3(P＜0.05)，有顯著差異?？?HBs陽性組肝細胞HBVcccDNA陰性，而抗-HBe陽性并有抗HBs陽性組分別為105拷貝/ml和103拷貝/ml，與前者比較，t=4.5、4.0(P＜0.01)，差異有非常顯著性意義。

表2 血清HBV-M與肝組織HBV cccDNA總量與細胞定量比較(copies/ml，，μg/L)

表2 血清HBV-M與肝組織HBV cccDNA總量與細胞定量比較(copies/ml，，μg/L)

與抗-HBs陽性比較，*P＜0.05(t=3.7、3.3)，＊＊P＜0.01(t=4.5、4.0)

2.3 HBV感染清除期血清標志物與CHB治療應答組肝組織HBV cccDNA比較 見表3。將既往HBV感染恢復期血清13例，HBsAg及HBV DNA均陰性，其中e抗體陽性6例，余為抗HBc陽性。肝組織HBV cccDNA陽性3例。CHB核苷類治療后應答，盡管HBV DNA陰性，e抗體陽性，肝組織HBV cccDNA仍均檢出陽性。

表3 既往HBV感染與CAH治療應答血清標志物與肝組織HBVcccDNA對比［n(%)］

3 討論

我國慢性乙型肝炎人數眾多，抗病毒達到我國CHB防治指南建議的治療終點后停藥容易復發(fā)，目前提倡長時間服藥，但核苷類長期用藥又難免發(fā)生耐藥。cccDNA是HBV前基因組RNA復制的原始合成模板，是HBV持續(xù)感染的關鍵因素。HBV感染宿主肝細胞后，其基因組進入肝細胞先生產HBV cccDNA，然后以HBV cccDNA為模板轉錄裝載成HBV rcDNA釋放入血。目前的抗病毒藥對其影響甚微。檢測肝組織HBV cccDNA對HBV的復制及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義［1］，可在一定程度上了解患者病情進展，對抗病毒藥物療效進行判斷，確定治療終點。

應用石蠟包埋組織切片DNA及血清DNA的提取技術，敏感的滾環(huán)擴增反應結合實時PCR擴增技術［2］，研究模版消亡時間與機制的關系，尋求預測血清學及組織復發(fā)及停藥指征。將CHB患者核苷類抗病毒治療前、應答后肝組織HBV cccDNA與HBeAg轉陰或轉換及HBV DNA的關系進行研究，結果顯示:既往HBV感染13例，抗-HBs及抗-HBc陽性各7和6例中，HBsAg陰性，仍有3例肝細胞中HBV cccDNA陽性。抗-HBs陽性組，肝細胞HBV cccDNA陰性，低于抗-HBe陽性及抗-HBs陽性組，χ2等于5.5(P＜0.01)，具有顯著差異?？?HBs陽性組肝組織HBV cccDNA總量，低于抗-HBe陽性及抗-HBs陽性組，t=3.7、3.3(P＜0.05)，有顯著差異。抗-HBs陽性組肝細胞HBV cccDNA檢測陰性，亦低于抗-HBe陽性及抗HBs陽性組，t=4.5、4.0(P＜0.01)，差異非常顯著。CHB核苷類治療后全應答，盡管HBV DNA陰性，抗-HBe陽性，肝組織HBV cccDNA仍均為陽性。HBsAg及HBV DNA均陰性的既往HBV感染者，肝組織HBV cccDNA陽性仍占23%。本研究的既往HBV感染組系自然恢復病例，CHB抗病毒治療應答病例目前難以達到類似臨床效果。

本研究資料顯示:血清HBsAg與肝組織HBV cccDNA具良好相關性［3～4］。目前我國乙肝抗病毒治療主要以干擾素及核苷類兩種類型，國外多個慢性乙型肝炎治療指南已建議以HBsAg陰轉為治療終點。而我國實際國情是無論何種抗病毒藥HBsAg陰轉率均不高，因此，應長程抗病毒治療。不能達成HBsAg陰轉的病例，治療終點就無法界定［5～6］，復發(fā)及耐藥在所難免。治療及復發(fā)交錯的總病程可能最終的結果是肝臟病理損害的逐漸加重。

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