一株蜜蜂病原物拮抗細菌的分離與鑒定

張其安 張慶娜 呂祝章 楊少波

（1.山東華康蜂業(yè)有限公司，山東日照 276500；2.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東日照 276826）

歐洲幼蟲腐臭病簡稱歐幼病，是蜜蜂幼蟲的一種細菌性消化道傳染病，在世界各地均有發(fā)生，具有傳播迅速、發(fā)病快的特點，中蜂（Apis cerana Cerana Fabricius）比意蜂（Apis mellifera ligustica Spinola）更容易受感染[1]。歐洲幼蟲腐臭病是由多種致病菌共同作用而引起的，但其主要病原是蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton），其它細菌為次生菌，具有加速被感染幼蟲死亡的作用[2]。蜂房蜜蜂球菌是一種革蘭氏陽性菌，但有染色特性不穩(wěn)定，有時候可能為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧[3-4]。蜂房蜜蜂球菌抵御不良環(huán)境的能力極強，能在蜂尸上存活數(shù)年，在粉蜜里也能保持長久的毒性，所以歐洲幼蟲腐臭病是一種傳染性極強的蜜蜂傳染病。

蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治方面的研究始于20世紀初，隨著四環(huán)素、磺胺類抗生素的相繼問世，使得蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的流行得以有效的控制[5]。當(dāng)前人們對無公害和綠色食品要求的與日俱增，蜂產(chǎn)品中多種抗生素殘留的檢測已經(jīng)成為許多國家蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢測的必檢項目。美國、歐盟、日本等國家已禁止含有多種抗生素殘留的蜂產(chǎn)品進入本國，這對我國蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治工作又提出了新的要求[6]。本研究以蜂房蜜蜂球菌為靶標(biāo)， 從土壤中分離獲得一株對蜂房蜜蜂球菌有高拮抗活性的細菌，對其進行了分離、鑒定研究，并對其抗菌譜及其發(fā)酵液的抑菌效果進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料

S1菌株由本實驗室分離獲得；大腸桿菌K12（Escherichia coli K12）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供；病原菌：蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）、幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）、蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）由本實驗室保存。

1.2 土壤樣品采集

在山地林區(qū)選擇無人為干擾、有機質(zhì)含量豐富、水分適宜的土壤采樣，注明采集地點、日期、土壤號和植被狀況等信息。

1.3 菌懸液制備及分離培養(yǎng)

稱取土樣10g放入無菌研缽中研碎，加入無菌蒸餾水100ml制成10-1的土壤懸液，搖床上200r/min振蕩30min，靜止5min，吸取上清液1mL 做系列稀釋，梯度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。分離采樣涂抹法，28℃～30℃培養(yǎng)，從12h起開始有明顯的菌落出現(xiàn)，根據(jù)微生物菌落的形狀、大小、表面結(jié)構(gòu)、邊緣形狀質(zhì)地、光澤、透明度、正反顏色和產(chǎn)生的可溶性物等特征，將單菌落接種到試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)并編號。

1.4 拮抗性能的檢測

采用平板對峙法測定菌株的拮抗性能，28℃培養(yǎng)96h，測量病原菌與篩選菌的相對距離，確定拮抗作用的大小，保留效果優(yōu)良的菌株。將菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵72h后滅菌并分離菌株獲得無菌發(fā)酵液，采用平板擴散法測定發(fā)酵液的拮抗活性，28℃培養(yǎng)6h～12h，記錄抑菌圈直徑，從而篩選獲得拮抗性和發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測定：菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察、需氧性和運動性測定、生長溫度測定、pH 5.7培養(yǎng)基中生長狀況觀察、耐鹽試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、脲酶試驗、糖醇類發(fā)酵試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解、明膠液化、H2S產(chǎn)生試驗、M.R.試驗（甲基紅試驗）、纖維素分解試驗，參照文獻[7]的方法進行。

1.5.2 DNA的G+Cmol%值測定和Tm值測定：參照文獻[14]方法進行。以大腸桿菌K12作為參比對照核實試驗誤差，計算G+Cmol%值。

1.5.316SrRNA序列同源性分析：以提取的總DNA為模板用16S rRNA基因的專一性引物R-ACGGCTAC CTTGTTACGACT，F(xiàn)-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG作為PCR引物，通過PCR擴增染色體DNA上的16S rDNA。將陽性克隆進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上Blast，從其結(jié)果中選出具有代表性的菌株，得到它們的16SrDNA全序列，在DNAMAN上建立其系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

經(jīng)拮抗性能的檢測和繼代培養(yǎng)，篩選到一株對蜜蜂病原細菌和真菌具有較強拮抗作用的細菌，編號S1。S1發(fā)酵液稀釋30～40倍后對幾種病原菌仍具有拮抗作用，說明該菌株具有良好的發(fā)酵性狀。

2.1 S1菌株的拮抗性能測定結(jié)果

S1菌株抑菌譜廣，對多種供試病原菌有較強拮抗作用。幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）、蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）、蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）具有較強的拮抗作用，結(jié)果見表1。

表1 S1菌株對多種病原細菌和真菌的拮抗作用

2.2 S1菌株的形態(tài)特征及培養(yǎng)特征

菌株革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢，有莢膜；鞭毛為兩端著生，運動能力不強；菌體呈桿狀，大小為（0.6～1.0）μm×（1.7～4.6）μm。在PDA平板上菌落呈圓形，表面中間突起，有光澤、光滑、濕潤；在澄清的肉湯中生長良好，在培養(yǎng)液表面無膜層；營養(yǎng)瓊脂柱表面有菌落，而且不斷蔓延變厚；穿刺線上有少量生長物，可以使明膠培養(yǎng)基液化；在尿素培養(yǎng)中生長良好，并產(chǎn)生淡黃色物質(zhì)。

2.3 S1菌株生理生化特征

S1菌株各項生理生化指標(biāo)如表2所示：該菌株為好氧菌；菌體在pH5.7的培養(yǎng)基中生長良好；不能在含有7%NaCl或0.001%溶菌酶的培養(yǎng)基上生長；不能利用檸檬酸作為碳源；可以利用；可以利用無機氮源（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2HPO4、NH4H2PO4和硝酸鹽。菌株過氧化氫酶試驗為陽性反應(yīng)；脲酶試驗為陰性反應(yīng)；葡萄糖、木糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇發(fā)酵試驗反應(yīng)為陽性，產(chǎn)酸并產(chǎn)生大量的氣體，不能利用甘油發(fā)酵產(chǎn)酸；水解淀粉試驗為陽性；可使明膠液化；能很好地水解纖維素；不產(chǎn)硫化氫；厭氧硝酸鹽生長，但不產(chǎn)氣；甲基紅試驗為陰性反應(yīng)；V-P 試驗為陽性反應(yīng)。

表2 S1菌株的生理生化特征

2.4 DNA的G+Cmol%值

根據(jù)DNA 變性過程中吸光度隨溫度上升變化曲線，獲得吸光度增加值的中點對應(yīng)溫度（Tm）為73.2 C，代入計算公式得G+Cmol%值為45.8，該值符合文獻[7]中對類芽孢桿菌DNA的G+Cmol%值的描述。

2.5 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及分析

利用16Sf/16Sr一對引物擴增得到的S1菌株16S rRNA序列長度大約為1426 bp，符合常規(guī)的16S rRNA序列長度。

經(jīng)測序，該菌株的16S rRNA核酸序列全長為1426 bp，將此序列與數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)種進行比較，與其同源性較高的菌株均屬于類芽孢桿菌屬，選取15株與S1序列相似性高的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA5.0軟件程序包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建以16S rRNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進化樹（圖1），可以看出，S1菌株與類芽孢桿菌屬中的Paenibacillus brasilensis進化距離最近，相似性為99%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和DNA的G+Cmol%含量分析，依據(jù)系統(tǒng)命名法將該菌株命名為：Paenibacillus brasilensisHK-1。

圖1 利用16S rRNA同源序列和鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)果與分析

傳統(tǒng)畜牧業(yè)中化學(xué)獸藥的過量使用不僅導(dǎo)致了許多病蟲害的抗藥性，更造成了生態(tài)環(huán)境的惡化。著這種情況之下，高效且對生態(tài)和環(huán)境安全的天然抗菌劑特別是微生物源抗菌劑收到越來越多的關(guān)注[8]。本研究從浮來山林地土壤中篩選到一株對蜂房蜜蜂球菌具有拮抗活性的菌株S1。通過鑒定，S1菌株屬類芽孢桿菌屬，16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)該菌株與類芽孢桿菌屬中的Paenibacillus brasilensis進化距離最近，因此將該菌株命名為：Paenibacillus brasilensisHK-1。

利用微生物活體防治蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病不僅有對其釋放風(fēng)險的擔(dān)憂，也受釋放技術(shù)及環(huán)境溫度、濕度等諸多因素的限制，所以研究者更期望從拮抗菌種提取活性物質(zhì)用于生物防治[9]。本實驗室對Paenibacillus brasilensis HK-1菌株的發(fā)酵、抗菌物質(zhì)分離純化及結(jié)構(gòu)鑒別工作正在進行中，期望該菌株及其抗菌物質(zhì)在控制蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病等蜜蜂細菌性疾病方面能有所作為。

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