生物素親和素系統(tǒng)在ECP的實(shí)驗(yàn)效能

趙俊芳 王學(xué)謙 李桂珍

嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（eosinophilia cationic protein，ECP）是一種相對(duì)分子質(zhì)量為21 ku的堿性蛋白，存在于嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）顆粒的基質(zhì)部分。其作為EOS的活性標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)疾病的診斷、治療和療效判定中。生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS）是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于生物素、親和素均可與蛋白質(zhì)、核酸、多糖和酶等生物活性物質(zhì)結(jié)合，同時(shí)還能與固相材料結(jié)合，減少反應(yīng)中的空間位阻，故其在ELISA中得到廣泛應(yīng)用。本研究將BAS應(yīng)用于ECP的檢測(cè)，評(píng)估其對(duì)實(shí)驗(yàn)效能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)自美國(guó)GE公司，二甲基酰胺（DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺生物素（NHS-d-生物素）、親和素（13 g/L）購(gòu)自Sigma公司；ECP抗原（Ag）0.1 g/L、抗ECP單克隆抗體（mAb）0.25 g/L購(gòu)自芬蘭Hytest公司；抗ECP多克隆抗體（pAb）購(gòu)自沃克生物科技公司，由免疫動(dòng)物制備；ECP雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ADL公司），96孔酶標(biāo)反應(yīng)板（美國(guó)Costar公司），酶標(biāo)分析儀（DNM－9602，北京普朗新技術(shù)有限公司）；洗板機(jī)（EL×50，美國(guó) BioTek Instruments公司）。

1.2 方法

1.2.1 HRP標(biāo)記抗ECPpAb 純化的抗ECPpAb經(jīng)改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記HRP，經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)確定其應(yīng)用濃度為1∶8 000，-86℃保存，常規(guī)應(yīng)用于-20℃保存[1]。

1.2.2 抗ECP mAb純化 用ECP親和層析柱純化抗ECP mAb[2]，經(jīng)非變性SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)其在83～175 kb之間有清晰條帶，無(wú)其他雜帶，在還原性SDS-PAGE電泳中，有2條清晰條帶。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其抗體濃度為0.96 g/L。

1.2.3 抗-ECPmAb的生物素化 取1 mL純化抗ECPmAb，經(jīng)0.1 mol/L碳酸鹽（pH 9.5）溶液透析后得到抗體600μL，其在280 nm處的吸光度（A280）為2.512。在抗體中加入3μL 20 g/L DMF溶解的生物素溶液，室溫反應(yīng)1 h。將該液體濾過(guò)經(jīng)pH7.4 PBS/proclin溶液平衡的Sephadex G25（柱長(zhǎng)12 cm，內(nèi)徑1.1 cm，流速800μL/min），收集第1個(gè)洗脫峰，共得液體2 mL，該液體為生物素化的抗ECPmAb，4℃保存[3]。繼續(xù)用pH7.4 PBS/proclin溶液洗柱，出現(xiàn)第2個(gè)洗脫峰（為游離生物素），洗至基線后，用儲(chǔ)存液繼續(xù)洗脫凝膠柱。

1.2.4 生物素化牛血清白蛋白（BSA） 將0.3 g BSA溶解于30 mL pH 9.5的碳酸鹽（0.1 mol/L）溶液中，充分?jǐn)嚢?0 min。將0.1 g NHS-d-生物素溶解于3 mLDMF中，充分?jǐn)嚢枞芙?。?種溶液混合，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，過(guò)0.22μm濾膜。將所得液體濾過(guò)Sephadex G25柱（柱體積為250 mL，流速3 mL/min）。接收第1個(gè)洗脫峰，所得液體為生物素化的BSA（biotinylation of BSA，BBC）,體積為64 mL，終濃度約為5 g/L。

1.2.5 建立直接包被抗體的檢測(cè)法 將1∶500稀釋的抗ECPmAb 150μL室溫過(guò)夜包被，洗滌后加入200μL封閉液，37℃封閉2 h，洗滌，加樣品稀釋液稀釋的ECP標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)血清，50μL/孔，再加入酶稀釋液1∶8 000稀釋的酶標(biāo)抗人ECPpAb100μL/孔，37℃水浴1 h。洗滌后加入底物A、B，避光室溫反應(yīng)15 min后加入終止液。30 min內(nèi)以450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，讀取吸光度。

1.2.6 建立先包被生物素的檢測(cè)法 1∶1 500稀釋BBC 150 μL包被過(guò)夜，洗滌后再包被1次。洗滌后加入150μL 375倍稀釋的親和素，室溫2 h，洗滌，加入封閉液200μL，37℃烤箱放置2 h。洗板3次后，每孔加入150μL稀釋（1∶1 200）的生物素化單抗，室溫放置2 h。檢測(cè)過(guò)程同1.2.5。

1.2.7 建立先包被親和素的檢測(cè)法 用1∶300稀釋的親和素150μL包板，室溫過(guò)夜，洗滌后加入封閉液200μL，37℃烤箱放置2 h。洗滌，每孔加入150μL稀釋（1∶1 200）的生物素化單抗，室溫放置2 h。檢測(cè)過(guò)程同1.2.5。

1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 將ECP抗原稀釋為0、2.5、5、10、20、50、100、200、500和1 000 μg/L的濃度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 試驗(yàn)效能評(píng)價(jià) （1）靈敏度：對(duì)濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低值進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)試，其平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差為檢測(cè)方法的靈敏度。（2）不準(zhǔn)確度：檢測(cè)高值（38μg/L），低值（8μg/L）標(biāo)本，每個(gè)測(cè)試做2次，取平均值，用相對(duì)偏差（Bias%）來(lái)表示測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確度。（3）重復(fù)性：對(duì)高值（38μg/L），低值（8 μg/L）標(biāo)本重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算其批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）。（4）穩(wěn)定性：將3種方法的試劑盒放置37℃烘箱于3、4、6、12 d取出，與4℃放置試劑盒測(cè)定同一批標(biāo)本，比較其穩(wěn)定性。

1.2.10 臨床血清標(biāo)本的檢測(cè) 選取2009年1月—2010年5月我院收治的過(guò)敏性皮膚病患者380例（患者組）和正常體檢者56例（對(duì)照組），均靜脈取血3 mL，室溫下放置60 min后，1 000 r/min離心15 min，血清放-20℃冰箱保存。用本研究制備的3種檢測(cè)試劑盒以及美國(guó)ADL雙抗夾心檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)ECP水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方法的線性范圍比較 3種方法的線性都較好，先包被生物素的檢測(cè)法和先包被親和素的檢測(cè)法的線性范圍較寬，見(jiàn)表1。

Table1 Comparison of linear rangebetween threemethods表1 3種方法線性范圍比較

2.2 3種方法的變異度、靈敏度和不準(zhǔn)確度比較 3種方法的變異系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.16，P>0.05）；重復(fù)性都較好，靈敏度、不準(zhǔn)確度相近，見(jiàn)表2。

Table2 Comparison of variation,sensibility and inaccuracy between three methods表2 3種方法的變異度、靈敏度和不準(zhǔn)確度比較

2.3 穩(wěn)定性比較 先包被親和素的檢測(cè)法最為穩(wěn)定，試劑盒在37℃條件下放置12 d，與4℃放置試劑盒對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.811，P>0.05）；直接包被抗體的檢測(cè)法次之，試劑盒在37℃放置12 d，與4℃放置試劑盒對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.98，P<0.05），先包被生物素的檢測(cè)法最不穩(wěn)定，試劑盒在37℃放置4、6和12 d，與4℃放置試劑盒對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為2.76、3.59、8.21，均P<0.05），見(jiàn)表3。

Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3種方法的試劑盒穩(wěn)定性結(jié)果 （μg/L，±s）

Table 3 Resultsof ELISA stability between threemethods表3 3種方法的試劑盒穩(wěn)定性結(jié)果 （μg/L，±s）

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2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 4種方法之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表4。

Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4種方法檢測(cè)患者組與對(duì)照組ECP水平比較（μg/L，±s）

Table4 Comparison of levelsof eosinophilia cationic protein usingfour methodsin patient group and control group表4 4種方法檢測(cè)患者組與對(duì)照組ECP水平比較（μg/L，±s）

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3 討論

近年來(lái)研究表明，血ECP水平與過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，ECP是疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)的較好指標(biāo)[4]。目前用于檢測(cè)ECP的商品試劑盒均為國(guó)外進(jìn)口，具有操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格都比較昂貴，故研制性價(jià)比高的國(guó)產(chǎn)ECP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒具有重要意義。

生物素親和素技術(shù)是近幾年來(lái)發(fā)展很迅速的一門生物學(xué)技術(shù)。其原理基于生物素與親和素的以下特征:（1）二者具有高度特異的親和性。（2）橋聯(lián)作用。（3）多級(jí)放大作用。BAS在酶促反應(yīng)中的作用是通過(guò)生物素親和素將免疫復(fù)合物與酶連接起來(lái)，形成放大酶免法。由于生物素親和素技術(shù)的多級(jí)放大作用，該法較免疫擴(kuò)散法和ELISA法具有更高的靈敏度。生物素親和素也可預(yù)包被在酶標(biāo)板孔內(nèi)，然后再將生物素化Ab（或Ag）包被于孔內(nèi)，從而解決了一些Ab（或Ag）不易包被的難題，也提高了檢測(cè)靈敏度。汪進(jìn)等[5]在檢測(cè)HBsAg的ELISA法中，采用鏈霉親合素預(yù)包被和Ab直接包被的酶標(biāo)板進(jìn)行比較，前者靈敏度可達(dá)0.15μg/L，后者為2 μg/L，而且前者在37℃下至少可保存3周。

本研究中，筆者先將生物素化BSA與酶標(biāo)板結(jié)合，然后加入親和素，再加入生物素化的抗ECP mAb，這樣可大大提高抗體的結(jié)合量，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度，增加線性范圍，同時(shí)可以節(jié)省一半以上的抗體，因?yàn)檫@種包被法不僅可增加固相載體上的抗體包被量，而且使其結(jié)合位點(diǎn)充分暴露，有利于免疫反應(yīng)的有效進(jìn)行[6]。先包被親和素，再加入生物素化的抗ECPpAb，也可增加線性范圍，且在本研究中，該法的穩(wěn)定性是最好的。本研究中，BBC包被后的試劑盒穩(wěn)定性稍差，可能是因?yàn)樽约褐苽涞腂BC不夠穩(wěn)定。就操作煩瑣程度而言，生物素包被法最為煩瑣，抗體包被法最簡(jiǎn)單。但是先包被生物素或親和素，封閉后再包被抗體，抗體包被時(shí)間只需2 h，且不需要再封閉，這在實(shí)際的檢測(cè)試劑盒制備中可以節(jié)省時(shí)間。

本研究通過(guò)抗ECPmAb的純化、生物素化及抗ECPpAb的酶標(biāo)、多種實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，制備了較為良好的ECP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。同時(shí)，通過(guò)對(duì)3種檢測(cè)方法的比較，發(fā)現(xiàn)生物素親和素系統(tǒng)可提高實(shí)驗(yàn)的敏感度，節(jié)約抗體包被時(shí)間，并可節(jié)省包被抗體的用量，為ELISA試濟(jì)盒的制備提供又一思路。

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