余舒瑩,趙 冰,張霞燕,張曉燕,王艷芳,張麗慧,盧韻碧,魏爾清
(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,浙江杭州 310058;2.杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室,浙江杭州 310036)
魚藤酮是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的殺蟲劑,在體外能損傷多巴胺能神經(jīng)元,產(chǎn)生與帕金森病(Parkinson's disease,PD)病理特征相似的表現(xiàn)。魚藤酮作為一種細(xì)胞毒性化合物,是特異性線粒體復(fù)合體I抑制劑,可選擇性地阻斷鐵-硫簇N和泛醌Q的作用,導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,造成氧化應(yīng)激及ATP生成障礙,從而引起細(xì)胞損傷。PC12細(xì)胞作為常用的PD細(xì)胞模型,是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株,其合成的酶類、表達(dá)的受體以及合成的神經(jīng)遞質(zhì)接近中腦多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元,已被廣泛用于 DA神經(jīng)元體外研究,特別是用于PD發(fā)病機(jī)制的研究。
花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶催化而生的成半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs),包括LTC、LTD和LTE,是一類活性很強(qiáng)的炎癥介質(zhì),其作用由 CysLT和 CysLT受體介導(dǎo)。CysLTs經(jīng)PD誘變劑魚藤酮處理后,可激活 PC12 細(xì)胞 5-脂氧酶,表明 CysLTs可能參與PD病變。魚藤酮還能增加小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞CysLT受體表達(dá),提示CysLT受體參與PD的炎癥調(diào)節(jié)過程。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明,腦缺血性損傷后,腦內(nèi)CysLT表達(dá)增加;CysLT受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特對(duì)腦缺血性損傷有保護(hù)作用。但是,DA神經(jīng)元CysLT受體是否也參與PD病變過程,CysLT受體拮抗劑能否保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷尚待研究。本研究觀察CysLT受體拮抗劑孟魯司特對(duì)魚藤酮引起PC12細(xì)胞損傷的作用,以及魚藤酮引起CysLT受體的表達(dá)、分布變化。
1.1 主要試劑與儀器 胰酶、多聚賴氨酸、魚藤酮、青霉素、鏈霉素、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和馬血清購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司;兔抗小鼠CysLT受體多克隆抗體由本研究室制備;異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Chemicon公司;孟魯司特(montelukast)由美國Merk公司贈(zèng)送。BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;CO培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司;多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Elx800 Universal Micro-plate Recorder)購自美國 Bio-TEK公司;SDS-PAGE膠電泳轉(zhuǎn)膜裝置購自美國 BIORAD公司;ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR Biosciences公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 高分化大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素10U/L、鏈霉素10μg/L),在5%CO培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng),2~3 d傳代,相近代數(shù)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%~90%時(shí),以0.25%胰酶消化3~4 min,將細(xì)胞收集到離心管中,1 000 r/min離心5 min后,棄上清。加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種在96孔和24孔中的細(xì)胞濃度分別為4 ×10/孔、2.5 ×l0/孔。細(xì)胞接種24 h后,進(jìn)行不同處理。
1.3 確定魚藤酮處理損傷濃度及形態(tài)觀察、活性測(cè)定(MTT法)PC12細(xì)胞種于96孔板,貼壁生長(zhǎng)24 h后,分別加入不同濃度魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L),對(duì)照組換用培養(yǎng)液,然后放入5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝影。
為測(cè)定細(xì)胞活性,處理結(jié)束后小心吸棄96孔板每孔的培養(yǎng)液,加入100μL MTT溶液(0.5 mg/ml,DMEM 培養(yǎng)基配制),在 5%CO培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)孵育2 h后,小心吸棄上清液,每孔加入100μL DMSO中止反應(yīng),振搖使生成的formazan顆粒充分溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光值(OD),OD值大小反映細(xì)胞的存活,以正常對(duì)照組MTT吸光值為基數(shù)100%,以藥物處理組與正常對(duì)照組吸光值的百分比,計(jì)算存活細(xì)胞百分率。
1.4 Western blotting測(cè)定CysLT受體蛋白用胰酶消化收集魚藤酮處理后的PC12細(xì)胞,以常規(guī)方法提取總蛋白,用考馬斯亮藍(lán)法做標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定提取液中的蛋白濃度。取100 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,先以100 V恒壓使Marker分開,再以150 V恒壓繼續(xù)電泳,直至溴酚藍(lán)條帶到達(dá)分離膠底部。然后,300 mA電轉(zhuǎn)移90 min至硝酸纖維素膜,經(jīng)TBST漂洗后,放入含5%脫脂奶粉中,平放在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上,室溫孵育120 min。取出硝酸纖維素膜,放入混有GAPDH(小鼠單克隆抗體1∶5000)及CysLT受體(1∶500)的一抗中,4℃冰箱中過夜,再用TBST漂洗10 min,共3次,與抗兔IRDye700DX?偶聯(lián)或抗鼠IRDye800DX?偶聯(lián)的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,漂洗后,用凝膠成像系統(tǒng)攝像,利用Quality One軟件以GAPDH為內(nèi)參,結(jié)果以CysLT受體和GAPDH的條帶光密度比值相對(duì)百分比表示。
1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞CysLT受體的分布 PC12細(xì)胞種于24孔板的蓋玻片上,貼壁生長(zhǎng)24 h后,細(xì)胞經(jīng)不同濃度魚藤酮處理24 h及3 μmol/L魚藤酮處理不同時(shí)間后,收集玻片,以0.01 mol/L PBS輕輕漂洗,冰甲醇冰上固定 5 min,再用 0.01 mol/L PBS清洗3次,加5%非免疫羊血清室溫封閉2 h。每孔各加一抗(1∶500),4℃孵育過夜;次日,PBS清洗3次后,加抗兔FITC標(biāo)記(綠色)或CY3標(biāo)記(紅色)的熒光二抗(1∶200),在室溫下孵育2 h,PBS清洗3次,并用碳酸甘油緩沖液(含1∶1000 DAPI,染細(xì)胞核)封片。在熒光顯微鏡下觀察CysLT受體在PC12細(xì)胞上的分布并攝影。
2.1 魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷變化 魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)處理 PC12細(xì)胞24 h后,光鏡下可見,隨著魚藤酮濃度的增大,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變,包括細(xì)胞突起變短、消失,細(xì)胞萎縮、變圓(圖1A);細(xì)胞活性明顯降低,分別降低至對(duì)照值的91%、81%、76%、76%、75%(P <0.05 ~0.01,圖 1B)。魚藤酮3 μmol/L的作用24 h的變化明顯、適度,因此,選擇該條件作為誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的條件。
2.2 CysLT受體拮抗劑對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響 常規(guī)培養(yǎng)條件下,孟魯司特0.2、1、5 μmol/L 作用24 h,對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響,而 10 μmol/L輕度增高細(xì)胞活性[100.0 ±2.3 vs 106.3 ±4.5(%),P <0.01,圖2A]。孟魯司特 0.2 ~10 μmol/L 預(yù)先孵育PC12細(xì)胞30 min,再用3 μmol/L魚藤酮處理24 h,結(jié)果表明1、5 μmol/L 孟魯司特可顯著抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低[100.0±2.9 vs 103.7 ± 3.1、98.8 ± 4.3(%)],而 0.2、10 μmol/L孟魯司特?zé)o顯著抑制作用[100.0±2.9 vs 90.9 ± 2.8、77.1 ± 4.5(%),P < 0.05 ~0.01,圖 2B]。
2.3 魚藤酮引起PC12細(xì)胞CysLT受體表達(dá)的變化 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明,PC12細(xì)胞在正常條件下表達(dá)CysLT受體(條帶約43 kD,圖 3A);魚藤酮 1、3、10 μmol/L 處理 24 h后,PC12細(xì)胞表達(dá)CysLT受體表達(dá)顯著增加[100 ± 4.4 vs 135.7 ± 6.3、146.9 ± 5.8、118.1±5.5(與 GAPDH 的比值),P <0.05,圖 3A]。魚藤酮3 μmol/L 作用3、24 h 后,CysLT受體表達(dá)顯著增多[100 ±4.2 vs 155.4 ±5.6,153.3 ±5.7(與 GAPDH 的比值),P <0.05,圖3B]。
2.4 魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞CysLT受體分布的改變 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CysLT受體正常情況下主要分布在細(xì)胞核;經(jīng)0.003 μmol/L魚藤酮處理24 h后CysLT受體分布未發(fā)生明顯變化,但 0.01 μmol/L 以上魚藤酮處理 24 h后,CysLT受體趨向分布于胞漿(圖 4A),當(dāng) 3 μmol/L魚藤酮處理從25 min開始,CysLT受體分布發(fā)生變化(圖4B)。
本研究結(jié)果表明,魚藤酮0.3~30 μmol/L處理24 h,可濃度依賴性降低PC12細(xì)胞活性,并改變細(xì)胞形態(tài)。CysLT受體拮抗劑孟魯司特對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用,提示CysLT受體可能參與PC12細(xì)胞的PD樣變化。孟魯司特的作用表現(xiàn)“鐘形”量效關(guān)系,即1、5 μmol/L能有效減輕細(xì)胞損傷,而 0.2、10 μmol/L 則無明顯減輕作用,這一結(jié)果與腦缺血整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。
CysLT受體表達(dá)、分布特點(diǎn)進(jìn)一步證實(shí)其與魚藤酮損傷的關(guān)系。魚藤酮1~10 μmol/L作用 24 h后,CysLT受體顯著增加,但 30 μmol/L未顯示該作用。鑒于魚藤酮慢性中毒誘導(dǎo)PD病變時(shí)能到達(dá)腦內(nèi)的濃度可能較低,因此,CysLT受體可能在PD發(fā)生中起調(diào)節(jié)作用。魚藤酮3 μmol/L誘導(dǎo)CysLT受體表達(dá)的時(shí)間過程具有“雙峰”特點(diǎn),即在3 h及24 h存在表達(dá)高峰,提示CysLT受體可能介導(dǎo)急性和后期效應(yīng)。在大鼠局灶性腦缺血后,缺血中心區(qū)在3~12 h及7~14 d也有2個(gè)CysLT受體表達(dá)高峰,分別介導(dǎo)急性神經(jīng)元損傷和后期小膠質(zhì)細(xì)胞激活。在本實(shí)驗(yàn)離體條件下,很可能由于魚藤酮誘導(dǎo)早期代謝障礙,促進(jìn)CysLT受體表達(dá)并介導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷;而后期(24 h)由于細(xì)胞因子等釋放促進(jìn)CysLT受體表達(dá),參與炎癥相關(guān)的變化。這一雙峰表達(dá)的機(jī)制和意義,還有待闡明。
免疫組化結(jié)果證實(shí),正常情況下 CysLT受體主要分布于PC12細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),隨魚藤酮作用濃度的升高,CysLT受體移位到胞漿;3 μmol/L魚藤酮作用的時(shí)間過程表明,從25 min開始,CysLT受體就發(fā)生明顯的移位。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,CysLT受體也主要分布在核內(nèi),其意義尚未闡明,但認(rèn)為與細(xì)胞增殖反應(yīng)有關(guān)。在 BV2 細(xì)胞,魚藤酮濃度依賴性誘導(dǎo)CysLT受體核移位,可能與小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān);但魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞表現(xiàn)損傷作用,其誘導(dǎo)的CysLT受體移位特點(diǎn)有別于BV2細(xì)胞。CysLT受體的這種移位特點(diǎn),與PC12細(xì)胞損傷究竟有什么關(guān)聯(lián),還需要進(jìn)一步研究。
綜上所述,本研究證明CysLT受體參與魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷,CysLT受體拮抗劑孟魯司特可減輕魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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