樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的CIK 細(xì)胞對(duì)肺癌生長(zhǎng)的抑制作用

陳詩萍，買世娟，余杏娟，柯妙拉，夏建川，高秋

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)和腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，生物治療已成為繼手術(shù)、化療、放療后的第 4 種腫瘤治療模式。當(dāng)前腫瘤生物治療技術(shù)包括分子靶點(diǎn)藥物、單克隆抗體、細(xì)胞因子、細(xì)胞免疫治療和基因治療。肺癌的生物治療依次經(jīng)歷了細(xì)胞因子（如 IL-2）療法、腫瘤殺傷細(xì)胞[如自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）]的過繼免疫治療、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）療法和單克隆抗體療法，但效果均不理想。根據(jù)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)及抗原呈遞過程方面的研究，無論何種生物治療方法，宿主體內(nèi)的抗原加工與呈遞是誘發(fā)宿主免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫的核心。迄今為止，樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是所發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞（APC）。有關(guān)研究已表明肺癌組織及外周血中 DC的數(shù)目與肺癌的預(yù)后呈成正相關(guān)，可是大多數(shù)肺癌組織中有 DC的數(shù)量減少或功能缺陷，因此考慮體外培養(yǎng) DC 并用抗原刺激制備腫瘤疫苗，用于治療術(shù)后殘余病灶或微轉(zhuǎn)移的患者。但由于肺癌是實(shí)體瘤，抗原性較弱，DC 疫苗的療效還未肯定，所以有必要通過實(shí)驗(yàn)觀察 DC 誘導(dǎo)的抗肺癌免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液為天津美德太平洋科技有限公司產(chǎn)品；GT-T561 無血清培養(yǎng)基為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品；GM-CSF、IL-4、IL-1、IL-2干粉為北京四環(huán)生物制藥有限公司產(chǎn)品；TNF-α、IFN-γ、CD3 購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；用 GT-T561 無血清培養(yǎng)基配成溶液。

1.1.2 儀器 JEM-2100F 型透射電鏡為日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品；CYTOMICS FC500 型流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) BALB/C 裸小鼠50只，雌雄兼用，鼠齡 4～6周，體重 16～18 g，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖傳代（合格證：粵檢證字 2002A009）。飼養(yǎng)條件：恒溫，空氣層流過濾。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺癌移植瘤模型建立 肺癌手術(shù)標(biāo)本剪切成 2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，接種裸鼠雙側(cè)背部皮下，模型建成后以等量移植瘤組織接種裸鼠，篩選有腫瘤生長(zhǎng)的裸鼠以腫瘤體積為主要參數(shù)按照隨機(jī)的原則分組予以處理。計(jì)算公式為腫瘤體積=π/6(a+b)3，其中 a 為腫瘤長(zhǎng)徑，b 為腫瘤短徑。

1.2.2 病理分析 取裸鼠肺癌移植瘤組織做病理切片，HE 染色觀察確定腫瘤類型，并與患者手術(shù)標(biāo)本的病理切片比較。

1.2.3 DC 培養(yǎng)及負(fù)載 取用于建立裸鼠移植瘤的肺癌標(biāo)本的同一患者的外周血，以淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離，所得的單個(gè)核細(xì)胞用 GT-T561 無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為6×106個(gè)/ml，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng) 1 h。貼壁的細(xì)胞成分中加入含有 IL-4（30 ng/ml）、GM-CSF（50 ng/ml）和慶大霉素（80 IU/ml）的GT-T561 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第 2、4、6 天補(bǔ)加含IL-4（30 ng/ml）和GM-CSF（50 ng/ml）的培養(yǎng)基。將同一患者手術(shù)切除的肺癌組織用反復(fù)凍融的方法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，在培養(yǎng)第 8 天加到DC 細(xì)胞中，濃度為100 mg/L，4 h 后加入工作濃度為10 ng/ml的TNF-α，培養(yǎng) 24 h 以刺激 DC成熟。

1.2.4 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) 上述未貼壁細(xì)胞中加入含慶大霉素（80 IU/ml）、IFN-γ（50000 IU）的GT-T561 無血清培養(yǎng)基中，第 2 天補(bǔ)加入細(xì)胞因子 IL-1、IL-2和CD3，使終濃度分別為50 ng/ml、50000 IU/ml和5μg/ml。培養(yǎng)第 5 天補(bǔ)加含 IL-2的GT-T561 無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)第 9 天，以 DC 與CIK 細(xì)胞 1∶10的比例將腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載的DC 加入 CIK 細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，所得的細(xì)胞為DC-CIK 細(xì)胞。

1.2.5 倒置顯微鏡及透射電鏡觀察 DC 細(xì)胞 每天應(yīng)用倒置顯微鏡觀察 DC 及CIK 細(xì)胞生長(zhǎng)情況。收集 DC，用 2% 多聚甲醛和22.5% 戊二醛混合液前固定，經(jīng) PBS 漂洗后，用 1% 鋨酸后固定，梯度乙醇脫水、滲透，LR White 樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.6 細(xì)胞表型分析 單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)第 5 天及抗原刺激后收獲 DC，用 PBS 洗滌重懸后加入PE 或 FITC 標(biāo)記的CD1a、HLA2DR、CD80、CD86、CD14 鼠抗人單抗，于培養(yǎng)第 5 天和第10 天即與DC 共孵育 24 h 后收獲 CIK 細(xì)胞，用PBS 洗滌重懸后加入 CY5-PE、PE 或 FITC 標(biāo)記的CD3、CD4、CD8 及CD56 鼠抗人單克隆抗體，4 ℃ 孵育 30 min，用 PBS 洗滌 2 次，重新懸浮，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析軟件為ELITE，樣本細(xì)胞數(shù)不少于5×105個(gè)。

1.2.7 荷瘤裸鼠處理及處理后觀察 按照隨機(jī)分組原則將裸鼠分為4組，分別為DC-CIK組、CIK組、DC組和NS組（生理鹽水對(duì)照組），每組9只。于裸鼠腫瘤同側(cè)腋窩皮下分別注射 DC-CIK細(xì)胞、未經(jīng)誘導(dǎo)的CIK 細(xì)胞和DC。注射劑量為1×106個(gè)/只，注射液體總量為0.1ml/只。對(duì)照組注射等量生理鹽水。每星期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況2 次，直至處理后約 1個(gè)月，處死裸鼠稱取腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率=（對(duì)照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型的建立

成功建立肺癌移植瘤模型，肺癌手術(shù)標(biāo)本和裸鼠移植瘤組織 HE 染色比較，兩者病理類型一致，但移植瘤的腫瘤惡性程度增加（圖 1）。

圖1 肺癌患者手術(shù)標(biāo)本與裸鼠肺癌移植瘤的病理學(xué)比較（×200）（A：高分化乳頭狀肺癌標(biāo)本；B：裸鼠移植瘤組織）Figure1 Pathological comparison between resected sample of lung cancer patient and implanted tumor in nude mice (×200)(A: Resected sample of lung cancer patient was diagnosed as well-differentiated palillary adenocarcinoma; B: Xenografted tumor in nude mice)

2.2 DC的形態(tài)及細(xì)胞表型結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后可見有少數(shù)細(xì)胞懸??；第3～4 天懸浮細(xì)胞較多，聚集成團(tuán)，細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，長(zhǎng)條形多見，有突起；培養(yǎng)第 6～7 天時(shí)細(xì)胞體積增大明顯，呈多邊形，長(zhǎng)的突起增多；于培養(yǎng)第 7 天及與腫瘤抗原共孵育 1 d 后透射電鏡觀察，可見 DC 有大量長(zhǎng)短不一的突起由胞體伸出，細(xì)胞核呈腎形并偏于一側(cè)，常染色質(zhì)增多，胞漿內(nèi)富含線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，較少溶酶體。與腫瘤抗原共孵育后，可觀察到 DC 細(xì)胞體積增大，突起增多增長(zhǎng)，包繞并吞噬腫瘤細(xì)胞裂解物的現(xiàn)象（圖 2）。

圖2 透視電鏡觀察 DC的超微結(jié)構(gòu)（A：DC 典型形態(tài)×2400；B：DC 捕獲抗原×6400）Figure2 Transmission electron microscopy of cultured DC[A: Typical appearance of DC (×2400); B: DC capturing antigen (×6400)]

培養(yǎng)第 5 天，HLA2DR、CD14 表達(dá)較高，CD80 表達(dá)量較低?？乖碳ず驝D86 表達(dá)較高，CD80 及HLA2DR 表達(dá)增加，CD1a 也有表達(dá)，CD14 表達(dá)有所降低（表1）。說明加入腫瘤抗原刺激后細(xì)胞表型有變化，因此，經(jīng)腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載的DC是成熟型。

表1 DC 細(xì)胞表型結(jié)果Table1 Surface phenotype of DC cells

2.3 CIK 細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞表型結(jié)果

培養(yǎng)第 3 天，CIK 細(xì)胞數(shù)目增多，體積也增大；第 7 天可見有細(xì)胞集落形成；當(dāng) DC 與CIK細(xì)胞共孵育 24 h 后所得的細(xì)胞即為DC-CIK 細(xì)胞，可見 CIK 細(xì)胞圍繞在DC的胞體及突起周圍。培養(yǎng)第 7 天電鏡觀察細(xì)胞核較大，核漿比例大，細(xì)胞核中異染色質(zhì)較多，胞漿內(nèi)細(xì)胞器較少。培養(yǎng)第 5 天及與腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載的DC 共孵育后檢測(cè) CD3、CD4、CD8 及CD56 抗原表達(dá)率，加入抗原刺激前后CD3、CD4 變化不明顯，而CD8 表達(dá)升高，CD56 表達(dá)降低（表 2）。

表2 CIK 細(xì)胞表型分析Table2 Surface phenotype of CIK cells

2.4 DC 誘導(dǎo)的CIK 細(xì)胞對(duì)肺癌移植瘤的生長(zhǎng)抑制

肺癌移植瘤在裸鼠體內(nèi)傳第 4 代時(shí)取等量移植瘤組織接種裸鼠，4組裸鼠腫瘤平均瘤重、瘤體積和腫瘤生長(zhǎng)抑制率見表3。DC-CIK 細(xì)胞對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有抑制作用，且較 CIK 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)（P＜0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用外周血作為DC 來源，用 75 cm2培養(yǎng)瓶貼壁的培養(yǎng)方法，并且應(yīng)用自體血漿作為DC 生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)來源。該法優(yōu)點(diǎn)是取材方便，制備過程簡(jiǎn)單，避免了應(yīng)用異種血清 FBS 對(duì) DC的干擾。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用患者自身手術(shù)切除標(biāo)本作為腫瘤抗原來源，比較了抗原負(fù)載前后的表面抗原表達(dá)情況，刺激前 CD80 表達(dá)率較低，刺激后HLA2DR、CD80 顯著升高，表明該法制備的DC 已經(jīng)成熟。成熟與未成熟 DC的功能不同，未成熟 DC 捕獲抗原的能力較強(qiáng)，但激發(fā) T 細(xì)胞免疫反應(yīng)能力較差，成熟的DC 具有較強(qiáng)的抗原呈遞功能，能將抗原呈遞給腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)制備的腫瘤抗原可以刺激DC 成熟并且使數(shù)量擴(kuò)增，培養(yǎng)前后比較擴(kuò)增率為4～5 倍。另外，本實(shí)驗(yàn)從外周血一次分離所得的單個(gè)核細(xì)胞中，以貼壁的單核細(xì)胞作為DC的前體細(xì)胞，同時(shí)未貼壁的淋巴細(xì)胞用來培養(yǎng) CIK 細(xì)胞，合理利用各種細(xì)胞成分，不致造成細(xì)胞浪費(fèi)，減輕患者負(fù)擔(dān)。培養(yǎng)所得的CIK 細(xì)胞通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞擴(kuò)增明顯，采用流式細(xì)胞儀表型分析 CIK細(xì)胞與DC 共孵育前后抗原表達(dá)率的變化，CD3表達(dá)率升高、CD4 變化不明顯，而 CD8 表達(dá)則有所升高，CD16/56 表達(dá)率明顯下降，說明 DC-CIK主要是表型為CD3+、CD8+的T 細(xì)胞，與報(bào)道中 CIK 細(xì)胞主要是 NK和T 細(xì)胞的說法不同，可能與腫瘤相關(guān)抗原 (TAA)-DC能特異性誘導(dǎo)CD8+ 細(xì)胞有關(guān)。

表3 DC-CIK 對(duì)肺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

表3 DC-CIK 對(duì)肺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用（ ）Table3 The antitumor effect of DC-CIK cells on xenografted tumor in nude mice ( )

實(shí)驗(yàn)組Groups腫瘤平均體積（cm3）Average volume (cm3)腫瘤平均重量（g）Average weight (g)抑制率（%）Inhibition rate (%)P 值P value DC-CIK 0.3183±0.32 0.4700±0.38 70.3 0 CIK 0.9836±0.31 1.0522±0.25 33.5 0.053 DC 0.9871±0.38 1.3000±0.25 17.9 0.291 NS 1.7134±1.32 1.5833±0.99 – –

由于裸鼠體內(nèi) T 細(xì)胞免疫缺陷，選用裸鼠實(shí)驗(yàn)對(duì)象消除了動(dòng)物體內(nèi) T 細(xì)胞的干擾，另外實(shí)驗(yàn)中以肺癌患者手術(shù)標(biāo)本建立移植瘤模型，能夠更好地模擬患者體內(nèi)情況，而且病理分析也發(fā)現(xiàn)移植瘤與手術(shù)標(biāo)本病理類型一致，但是病理分級(jí)升高，這與患者術(shù)后微小殘余病灶的復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移的情況相似。所以本實(shí)驗(yàn)實(shí)際上是以裸鼠為媒介模擬患者體內(nèi)情況，觀察 DC-CIK的體內(nèi)抗腫瘤作用，做到觀察的個(gè)體化。用肺癌手術(shù)切除標(biāo)本建立移植瘤模型的過程中，發(fā)現(xiàn)傳代后接種成瘤率約為75%，所以本實(shí)驗(yàn)不能預(yù)先觀察 DC 對(duì)肺癌移植瘤發(fā)生的預(yù)防作用，只能觀察其對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在處理后的第 15 天左右，DC-CIK組中腫瘤開始較快地生長(zhǎng)，這說明了DC-CIK 對(duì)體積較小的腫瘤抑制作用明顯，而隨著腫瘤體積增大，這種抑制作用減小。因而臨床上 DC應(yīng)當(dāng)用于治療手術(shù)后微小殘余病灶和微轉(zhuǎn)移病灶，而且應(yīng)當(dāng)縮短注射的間期。本實(shí)驗(yàn)通過荷瘤裸鼠體內(nèi)抗瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 DC-CIK 細(xì)胞抗肺癌作用明顯高于CIK 細(xì)胞的作用，提示 DC-CIK 細(xì)胞治療是更為有效的抗肺癌生物治療方法，為DC 疫苗用于臨床治療提供了理論依據(jù)。

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