LC-MS/MS測定大鼠血漿中黃藤素含量及其藥代動力學(xué)研究

田開鑫，肖丹，彭衡陽，劉天強(qiáng)

黃藤素（fibrauretin），也叫巴馬?。╬almatine），系從中藥植物黃藤的干燥莖中提取得到的一種季胺鹽異喹啉類生物堿。它主要存在于防己科、蕓香科、毛茛科和小檗科及旋花科植物中，但以防己科的黃藤含量最高，可達(dá) 3% 左右。黃藤素呈黃色針狀結(jié)晶，味極苦，在熱水中易溶但在水中略溶。黃藤素一般通過 NaCl 鹽析分離和純化制得，因此，它常以鹽酸鹽的形式存在[1]。臨床上，黃藤素主要用于抗菌消炎，在泌尿生殖系統(tǒng)[2]、呼吸系統(tǒng)[3]、消化系統(tǒng)[4]及外科感染等方面有著廣泛應(yīng)用。此外，黃藤素還具有抗病毒、提高免疫、抗心律失常等藥理作用[5]。血漿內(nèi)黃藤素的測定方法較多，先后出現(xiàn)了紫外分光光度法[6]、高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FLU）法[7]、(RP)-HPLC 法[8]等。但是，由于黃藤素體內(nèi)吸收很差，相對于肌肉注射，其口服生物利用度僅為1.31%[9-10]，而現(xiàn)有的黃藤素檢測方法大多靈敏度較低，難以達(dá)到黃藤素體內(nèi)濃度的檢測。而且樣品的處理大多要經(jīng)過萃取并加入內(nèi)標(biāo)，操作繁瑣，或者需要利用固相萃取而使分析成本高昂。鑒于此，本研究擬建立一種靈敏、專一、快速的黃藤素大鼠血漿中含量測定的方法，為黃藤素的藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 Agilent 1200 系列高壓快速分離液相系統(tǒng)和Agilent 6410BQQQ 三重四級桿質(zhì)譜均為美國 Agilent公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥品及試劑 黃藤素（純度 ≥ 95%）購于陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司；黃藤素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110732-200506）購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲酸均為色譜純，為美國 Fisher公司產(chǎn)品；水為重蒸水，自制；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 雄性 SD 大鼠，體重（220±20）g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2008-21。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18600 Bar（1 Bar=100000 Pa）2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流動相：水（含 0.1% 甲酸）∶乙腈（70∶30）；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：1 μl。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測；干燥氣溫度：350 ℃，裂碎電壓151 eV，碰撞池電壓 28 eV；干燥氣流速：10ml/min；毛細(xì)管電壓：4000 V，霧化氣壓力：45 psi（1 psi=6.895 kPa）。檢測離子：352-336。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取黃藤素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置于5ml 棕色量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到 2.21 mg/ml 儲備液。將儲備液用乙腈分別稀釋，制得濃度為：0.442、2.21、4.42、11.05、22.1和44.2 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.4 給藥及生物樣品處理 取雄性 SD 大鼠5只，灌服 40 mg/kg 黃藤素，分別于灌胃后0.08（5 min）、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0和36.0 h 眼底靜脈取血，置于預(yù)先肝素化的離心管中，離心后取血漿置于涂有 1% 肝素鈉的離心管中，2620×g 離心 5 min，吸取血漿 100 μl，加入 3 倍量乙腈，渦旋振蕩（80 r/min）10 min，7280×g，離心 10 min，取上清液進(jìn)樣。

1.2.5 體內(nèi)分析方法的建立

1.2.5.1 專屬性考察 取空白血漿 + 標(biāo)準(zhǔn)品、空白溶劑、空白血漿分別按照“1.2.4”中樣品的處理方法處理，考察方法的專屬性。

1.2.5.2 線性關(guān)系考察 吸取空白血漿 100 μl，分別加入 20 μl 不同濃度的黃藤素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述“1.2.4”中樣品的處理方法進(jìn)行處理和測定，記錄黃藤素的峰面積 Ai，以 x=黃藤素濃度（ng/ml）對 y=Ai 進(jìn)行線性回歸。

1.2.5.3 精密度考察 取空白血漿 100 μl，分別添加高、中、低 3 種濃度的黃藤素對照品溶液（2.21、11.05、44.2 ng/ml）作為質(zhì)控樣品（Qc）；每批質(zhì)控樣品各 5個(gè)，連續(xù)測定 3 批（每天測定1 批次）。用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 Qc 樣品的測定濃度，經(jīng)方差分析求得本法的精密度。

1.2.5.4 穩(wěn)定性考察 取配制的高、中、低 3 種濃度的黃藤素 Qc 樣品，分別在室溫（20 ℃）和–20℃ 保存，室溫保存樣品在4和8 h取樣，–20 ℃ 保存樣品在第 7 天取樣，分別進(jìn)行色譜測定。對每一個(gè)濃度取 5個(gè)樣本分析，測定黃藤素含量，初始含量為C1；室溫下放置4 h 后黃藤素的含量為C2；室溫下放置8 h 后黃藤素的含量為C3；–20 ℃下放置7 d 后黃藤素含量為C4，以 Ci/C1計(jì)算不同條件下樣品的穩(wěn)定性。

圖1 空白血漿 + 標(biāo)準(zhǔn)品（A）、空白溶劑（B）、空白血漿（C）的多級反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）色譜圖Figure1 The representative chromatograms of (A) a blank rat plasma sample with fibrauretin (5 ng/ml) and (B) a blank acetonitrile solution sample and (C) a blank rat plasma sample

1.2.5.5 回收率 方法回收率：取配制的高、中、低 3 種濃度生物樣品，每一個(gè)濃度各 5個(gè)樣本。按照“1.2.4”中樣品的處理方法進(jìn)行處理，所得樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得濃度與加入的濃度之比即得方法回收率（%）。提取回收率：取配制的高、中、低 3 種濃度生物樣品，每濃度各 5個(gè)樣本。按照“1.2.4”中樣品的處理方法進(jìn)行操作，所測得峰面積，與相應(yīng)濃度黃藤素乙腈溶液直接進(jìn)樣所測得峰面積相比得提取回收率（%）。

1.3 藥物動力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

根據(jù)所獲得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，用 DAS 2.0進(jìn)行處理，擬合血藥濃度-時(shí)間曲線模型，并采用統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算出各項(xiàng)藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)分析方法的建立

2.1.1 專屬性 結(jié)果見圖 1，說明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及空白溶劑對樣品測定無干擾。

2.1.2 線性關(guān)系 以血藥濃度對峰面積建立回歸方程，得到血漿樣品中黃藤素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可知，血漿中黃藤素濃度在0.442～44.2 ng/ml 內(nèi)濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999）。

表1 黃藤素在血漿中的線性關(guān)系Table1 Linear relationship of fibrauretin in rat plasma

2.1.3 精密度 經(jīng)方差分析求得本法的精密度，數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，測定血漿中次烏頭堿濃度的分析方法符合日內(nèi)和日間 RSD 均小于15%的要求，該方法可用于黃藤素的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)試驗(yàn)。

2.1.4 穩(wěn)定性 結(jié)果見表3，樣品在室溫 8 h 內(nèi)較穩(wěn)定，–20 ℃ 冰凍及凍融條件均較穩(wěn)定。

2.1.5 回收率 方法回收率：結(jié)果見表4；提取回收率：結(jié)果見表5。由表中數(shù)據(jù)可見方法回收率與提取回收率均為85%～115%，符合生物樣品分析方法要求。

2.2 藥時(shí)曲線

大鼠灌胃 40 mg/kg 黃藤素后，利用上述測定方法測定大鼠血漿中的黃藤素含量，以血藥濃度理論模擬值與試驗(yàn)測定值的相關(guān)系數(shù) r2最大和AIC 最小為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果大鼠灌服黃藤素的藥動學(xué)符合二室模型，其平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖 2。

表2 血漿中黃藤素 LC-MS 測定法的精密度考察Table2 Precision results of LC-MS method of fibrauretin in plasma

表3 血漿樣品穩(wěn)定性考察Table3 Stability of rat plasma sample

表4 方法回收率結(jié)果Table4 Analytical recovery of fibrauretin in rat plasma

表5 提取回收率結(jié)果Table5 Extraction recovery of fibrauretin in rat plasma

圖2 大鼠灌胃后黃藤素的血藥濃度-時(shí)間曲線Figure2 Mean ( ) plasma concentration-time curve of fibrauretin in rats (n=5) after an oral administration of 40 mg/kg fibrauretin

2.3 藥動參數(shù)

黃藤素口服后，大鼠血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算其主要藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表6。

由圖 2和表 6 可知，本實(shí)驗(yàn)建立的黃藤素LC-MS/MS 測定方法可以用于黃藤素的體內(nèi)藥動學(xué)研究。

表6 口服黃藤素在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)Table6 The pharmacokinetic parameters of fibrauretin in rats (n=5) following an oral administration of 40 mg/kg fibrauretin

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠血漿中黃藤素 LC-MS/MS測定方法，該方法專一性好，靈敏度高，操作方便易行，并應(yīng)用所建立的方法成功地檢測了黃藤素大鼠灌胃后的血藥濃度，用 DAS2.0 計(jì)算了其藥動學(xué)參數(shù)。所建立的方法不需使用內(nèi)標(biāo)，采用乙腈直接沉淀蛋白法處理血漿樣品而非萃取法，使操作方便、簡單；而且使用高壓快速液相分離系統(tǒng)，使分析時(shí)間降低到 2 min，因此，我們建立的黃藤素體內(nèi)分析方法真正達(dá)到了快速、方便，為其體內(nèi)研究提供了基礎(chǔ)。

[1]Tang AL, Liu XF, Feng DM.Extracted using the boiling method and the cold soak method the composition of palmatine in fibrauretin comparative study.Acat Med Sinica, 2003, 16(1):75-76.(in Chinese)唐愛蓮, 劉笑甫, 馮冬梅.用煎煮法和冷浸法對黃藤中巴馬丁成分提取的比較研究.華夏醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 16(1):75-76.

[2]Wu YR.Clinical observation on treating 102 cases of chronic pelvic inflammatory disease with fibrauretine injection.Guiding J TCM,2007, 13(6):46, 49.(in Chinese)伍幼如.黃藤素注射液治療慢性盆腔炎102例臨床觀察.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2007, 13(6):46, 49.

[3]Wu CY, Zhang Y, Shi W, et al.Clinical observation on treating acute upper respiratory tract infection disease with fibrauretine tablet.China Med Herald, 2009, 6(5):168.(in Chinese)吳春艷, 張艷, 史偉,等.黃藤素片治療急性上呼吸道感染臨床觀察.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2009, 6(5):168.

[4]Wu CY, Zhang Y, Shi W, et al.Clinical observation on treating acute diarrhea disease with fibrauretine tablet.China Med Herald, 2009,6(9):43-44.(in Chinese)吳春艷, 張艷, 史偉,等.黃藤素片治療急性腹瀉的臨床療效觀察.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2009, 6(9):43-44.

[5]Bhadra K, Maiti M, Kumar GS.Molecular recognition of DNA by small molecules: at base pair specific intercalative binding of cytotoxic plant alkaloid palmatine.Biochim Biophys Acta, 2007,1770(7):1071-1080.

[6]Zhou M, Yang XL, Cheng ZT.Determination of palmatine hydrochloride in fibrauretinum injection by UV spectrophotometry.Chin J Synthetic Chem, 2001, 9(4):379-381.(in Chinese)周敏, 楊秀蘭, 成中太.紫外分光光度法測定黃藤素注射液中鹽酸巴馬汀含量的探索.合成化學(xué), 2001, 9(4):379-381.

[7]Zhang H, Yu C, Hong YC, et al.Determination of palmatine in serum by HPLC-FLU.Acta Pharm Sinica, 2000, 35(7):518-520.(in Chinese)張慧, 余琛, 洪有采,等.HPLC-FLU 法測定血清中黃藤素的含量.藥學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 35(7):518-520.

[8]Jin CH, Jiang XH, Xu T, et al.Assay method for sustained-release palmatine tablet in beagle dog.China Pharm, 2009, 20(6):420-421.(in Chinese)金朝輝, 蔣學(xué)華, 徐珽,等.黃藤素緩釋片在Beagle犬體內(nèi)測定方法研究.中國藥房, 2009, 20(6):420-421.

[9]Zhou Y, Jiang XH.The absorption kinetics of Palmatine in stomach and intestines of rat.West China J Pharm Sci, 2006, 21(2):168-169.周玥, 蔣學(xué)華.黃藤素在大鼠胃腸道中的吸收動力學(xué).華西藥學(xué)雜志, 2006, 21(2):168-169.

[10]Huang JM, Wang GQ, Jin YE, et al.Determination of palmatine in canine plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with solid-phase extraction.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007, 854(1-2):279-285.