吳 鋒，林日陽，何立群

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎內科、肝腎疾病病證教育部重點實驗室、上海市高校中醫(yī)內科E-研究院，上海 200021)

中醫(yī)藏象理論認為“腎藏精，主骨生髓”。目前臨床上多用補腎中藥治療骨質疏松等骨代謝疾病，補腎中藥可通過多環(huán)節(jié)、多途徑調節(jié)骨形成與骨吸收［1］?，F代醫(yī)學從腎臟對鈣磷及激素內分泌的角度來闡釋中醫(yī)的腎主骨理論。腎主骨理論的實驗研究動物模型，是用人為方法復制腎損傷或骨損傷的動物模型，然后從組織學、病理學、形態(tài)計量學、生物力學、分子生物學等角度觀察骨或腎的變化，以此來尋找腎損及骨和骨損及腎的客觀依據［2］?！澳I主骨”的理論體系研究中還缺少應用體外直接客觀的實驗方法。腎小球系膜細胞是腎小球的主要固有細胞之一，成骨細胞是骨的主要功能細胞，我們根據中醫(yī)“腎主骨”的理論，應用體外細胞培養(yǎng)技術，避免體內復雜的影響因素，首次將腎臟的主要功能細胞-腎小球系膜細胞直接作用于骨的主要功能細胞-成骨細胞，在細胞水平觀察兩者的內在聯(lián)系，為進一步研究和證實中醫(yī)“腎主骨”理論提供更直接及客觀確切的現代科學實驗基礎，為中醫(yī)理論的客觀化研究和臨床研發(fā)補腎中藥防治骨及骨關節(jié)疾病提供新的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新生(出生24 h以內)紅皮 SD大鼠和100g SD雄性大鼠，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要實驗試劑 RPMI-1640基礎培養(yǎng)液(GIBCO)、堿性磷酸酶(ALP)及骨橋蛋白(OPN)檢測試劑(Biotnt公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞提取分離 (1)腎小球系膜細胞提取分離:在無菌條件下分離SD雄性大鼠腎臟，采用系列篩網法分離腎小球，取上清液經0.1%IV型膠原酶消化后，加入RPMI-1640基礎培養(yǎng)液制成懸液，使腎小球懸液均勻種植在瓶底。將培養(yǎng)瓶置入37℃5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。3周后傳代，選擇第3～5代系膜細胞用于實驗。采用免疫熒光法進行鑒定，抗結蛋白抗體陽性、抗細胞角蛋白抗體陰性證實為系膜細胞;(2)成骨細胞提取分離:取新生SD大鼠顱蓋骨剪碎，經胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶振蕩，收集上清液離心，吸棄上清液。加入RPMI-1640基礎培養(yǎng)液，制成細胞懸液，采用反復貼壁法純化，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置入5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞匯合達80%左右培養(yǎng)瓶底，即進行傳代。本實驗均采用3～5代細胞。細胞鑒定:顯微鏡下見細胞貼壁生長呈三角形、紡錘形和多角形等多種形態(tài)，行堿性磷酸酶染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的細胞核及細胞質上形成的灰黑至深黑色顆粒狀或片狀沉淀。

1.2.2 成骨細胞的分組培養(yǎng) 取成骨細胞以5×104個/ml，100ul/孔接種于96孔培養(yǎng)板內，細胞貼壁后更換含0.5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后分成正常血清組和系膜細胞組2組，給予2種不同培養(yǎng)液，每組8孔，隔天換液1次。

1.2.3 培養(yǎng)液的制備 (1)正常血清組培養(yǎng)液:SD雄性大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血、離心(3000r/min，20 min)并收集上清液，－20℃冷藏，使用前4℃冰箱解凍過夜，56℃水浴滅活20min過濾除菌，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至10%;(2)系膜細胞組培養(yǎng)液:取系膜細胞均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，至細胞鋪占瓶底約80%。換用含10%的正常小鼠血清RPMI-1640培養(yǎng)液，10ml/瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，3d后吸取上清液備用。使用時用正常血清組培養(yǎng)液稀釋至20%。

1.2.4 成骨細胞增殖檢測(MTT法)各組分別在培養(yǎng) 24h、48h、72h、120h 后，加入 20μl新鮮配制過濾除菌的MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，倒置 96孔板于吸水紙上，加入 100μl DMSO，振蕩孵育 10min，在酶標儀上檢測光密度(OD)值，檢測波長490 nm，每組8孔。

1.2.5 成骨細胞上清液ALP及OPN濃度的檢測 各組在培養(yǎng)72h后吸取培養(yǎng)液，ELISA法檢測ALP及OPN濃度，步驟嚴格按照說明書，每組5孔。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 成骨細胞增殖的情況

表1顯示，系膜細胞組和正常血清組的成骨細胞都隨著時間而逐步增殖。在正常血清組，后3個時間點與培養(yǎng) 24h相比，分別增長了 40.7%、66.8%、322.8%。在系膜細胞組后3個時間點與培養(yǎng) 24h 相比，分別增長了 24.1% 、54.7% 、176.1% 。但系膜細胞組在各時間點的增殖要明顯快于正常血清組(P＜0.05)，系膜細胞組比正常血清組各時間點分別高 72.4% 、52.1% 、60.0% 、12.6% ，說明腎系膜細胞培養(yǎng)上清液能作用于成骨細胞，促進成骨細胞的增殖。

表1 成骨細胞增殖的OD值(n=8，±s)

表1 成骨細胞增殖的OD值(n=8，±s)

注:與正常血清組比較:*P＜0.05

24h 48h 72h 120h正常血清組 0.337 ±0.038 0.474 ±0.067 0.562 ±0.053 1.425 ±組 別0.151系膜細胞組 0.581 ±0.064* 0.721 ±0.202* 0.899 ±0.149* 1.604 ±0.040*

2.2 成骨細胞上清液ALP及OPN濃度的情況

表2顯示，在第3天系膜細胞組的ALP濃度高于正常血清組30.5%，要明顯高于正常血清組(P＜0.05)。系膜細胞組的 OPN濃度高于正常血清組55.0%，說明腎系膜細胞培養(yǎng)上清液能作用于成骨細胞，促進成骨細胞分泌ALP及OPN。

表2 第3天成骨細胞上清液ALP及OPN的濃度(n=5，±s)

表2 第3天成骨細胞上清液ALP及OPN的濃度(n=5，±s)

注:與正常血清組比較:*P＜0.05

組 別 ALP(μg/L)OPN(μg/L)正常血清組13.72 ±10.16 2.840 ±0.476 8.85 ± 8.85系膜細胞組 3.707 ±0.294*

圖1 各時間點成骨細胞增殖情況

3 討論

《醫(yī)經精義》中記載:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足者骨強。”《素問·逆調論》曰:“腎者水也，而生于骨，腎不生，則髓不能滿，故寒甚至骨也，所以不能凍栗者……病名曰骨痹，是人當攣節(jié)也?！敝嗅t(yī)從生理及病理上都對“腎”與“骨”的密切聯(lián)系作了詳盡闡述。在治療學上，《圣濟總錄·諸痹門》中強調以補腎填精為君藥治療骨痹。對中醫(yī)“腎主骨”理論可以從兩個方面理解:一是解剖學意義上的腎臟對骨代謝的影響，其實質主要指腎臟1-α羥化酶的活性及腎臟對鈣磷代謝的調控;二是中醫(yī)學綜合意義上的腎對骨代謝的復雜調控網絡，既包括對下丘腦-垂體-靶腺軸不同環(huán)節(jié)、不同層面功能的概括，也包括骨骼組織局部微環(huán)境各種調節(jié)因子的功能［3］。

中醫(yī)“腎主骨”理論中的“腎”雖與現代解剖學上的腎臟并不完全等同，但腎臟是“腎主骨”理論體系中最主要的器官。腎臟與骨皆發(fā)生于胚胎外胚層，是同源器官，在發(fā)生學上有著相關性。目前對“腎主骨”的現代科學研究中，腎臟對骨代謝的影響主要是從腎臟對1-α羥化酶的活性及對鈣磷代謝的調控方面。近年來的研究表明，Wnt/β-Catenin-BMP信號途徑在調節(jié)腎臟發(fā)育、功能活動和骨代謝中具有重要的作用［4、5］。但目前的現代科學研究方法都未將腎臟與骨直接相聯(lián)系。

腎小球系膜細胞是腎小球的主要固有細胞之一，具有分泌多種生物活性物質的功能。成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞，是骨形成過程中的重要功能細胞，其主要功能是分泌骨基質，不僅與骨的形成密切相關，而且在骨吸收過程中也起關鍵性作用。成骨細胞對骨組織的生長發(fā)育、骨代謝平衡、骨量維持和損傷修復起關鍵作用。本實驗首次應用體外細胞培養(yǎng)技術，排除了體內多種因素的相互影響，將腎小球系膜細胞直接作用于成骨細胞，在細胞水平直接觀察兩者的內在聯(lián)系，為“腎主骨”提供更直接及客觀的現代科學實驗方法。

實驗結果表明，腎系膜細胞能直接促進成骨細胞的增殖及功能。系膜細胞組在各時間點要比正常血清組的成骨細胞增殖程度都明顯增加。ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，與成骨細胞的分化有密切關系，是成骨細胞早期分化的標志物，其活性的明顯升高是成骨細胞成熟的一大特征，也是評價機體成骨活性的特異性指標［6］。我們參照文獻［7］，在成骨細胞培養(yǎng)第3天時檢測ALP濃度。結果表明，在第3天時系膜細胞組上清液的ALP濃度比正常血清組明顯增高。OPN是一種硫基化和磷酸化的糖蛋白，是骨組織中的主要非膠原蛋白。OPN在成骨細胞中廣泛存在，不同成熟階段的成骨細胞均能合成和分泌OPN，是成骨細胞的表型之一。結果表明，在第3天時系膜細胞組上清液的OPN濃度比正常血清組增高55.0%，說明腎小球的主要固有細胞可以直接促進骨形成，調節(jié)骨代謝。通過檢測腎小球系膜細胞分泌的上清液對成骨細胞增殖及功能的影響，為進一步研究中醫(yī)“腎主骨”理論現代科學基礎提供新思路、新途徑。

［1］王擁軍，卞 琴，崔學軍，等.“腎主骨”理論研究的思路與方法［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2010，24(1):8-12.

［2］王善金.腎主骨理論的現代研究概況［J］.光明中醫(yī)，2006，21(2):54-55.

［3］孔月晴.腎主骨、腎與骨代謝內涵探討［J］.光明中醫(yī)，2010，25(3):353-354.

［4］Lyons JP，Miller RK，Zhou X，et al.Requirement of Wnt/beta-Catenin signaling in pronephric kidney development［J］.Mech Dev，2009，126(34):142-159.

［5］Kazama I，Mahoney Z，Miner JH，et al.Podocyte-derived BMP7 is critical for nephron development［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(11):2181-2191.

［6］李玉彬，謝利民，李 敏，等.健脾補腎方含藥血清對體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質干細胞定向分化的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18(5):13-15.

［7］沈祥春，楊如會，彭 佼，等.健骨固本膠囊含藥血清對大鼠成骨細胞作用的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(2):278-281.