雷靜，潘超然

（山東科技職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

黃花魚(yú)又名黃魚(yú)、石首魚(yú)，系鱸形目，石首魚(yú)科，黃魚(yú)屬，屬洄游性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，是我國(guó)傳統(tǒng)四大經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，主要分布在我國(guó)東海、黃海南部、臺(tái)灣海峽以及南海。黃花魚(yú)營(yíng)養(yǎng)豐富，每100克中含蛋白質(zhì)17.6 g，脂肪 0.8g，鈣 33mg，磷 135mg，鐵 10mg，含熱量 326J[1]。除了食用價(jià)值外，黃花魚(yú)的藥用價(jià)值非?？捎^，其性溫、味甘、無(wú)毒，全身都是寶，肉、耳石、鰾、膽汁、精巢均可入藥[2]。耳石可清熱通淋，平肝熄風(fēng)，治小便澀痛不利，尿路結(jié)石及解毒；魚(yú)膽汁可清熱解毒、平肝降脂；魚(yú)鰾克滋陰添精、養(yǎng)血止血、潤(rùn)肺健脾，治產(chǎn)后風(fēng)癥[1]。

黃花魚(yú)蛋白質(zhì)含量豐富，主要以冷凍和腌制品為主，在腌制品的加工過(guò)程中，內(nèi)臟常被作為下腳料棄掉，其下腳料約占全魚(yú)質(zhì)量的20%以上，內(nèi)含藥用價(jià)值豐富的鰾、膽囊、精巢等。這些下腳料如不被加以利用，不但造成環(huán)境污染，而且致使大量蛋白質(zhì)資源流失。本文對(duì)這些下腳料進(jìn)行復(fù)合酶解、綜合利用，提高其附加值，目前酶解方法多見(jiàn)于鮑魚(yú)、鯽魚(yú)、羅非魚(yú)等的研究，鮮見(jiàn)有關(guān)黃花魚(yú)內(nèi)臟酶解的報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃花魚(yú)內(nèi)臟復(fù)合酶解條件的研究，確定最佳工藝參數(shù)，以提高水解液中氨基態(tài)氮的得率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

黃花魚(yú)內(nèi)臟；木瓜蛋白酶（80萬(wàn)單位/g)；堿性蛋白酶（20萬(wàn)單位/g）；中性蛋白酶（20萬(wàn)單位/g）。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、酚酞指示劑、37%中性甲醛、中性飽和草酸鉀、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸。

1.1.3 儀器

TE313S-DS電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；SHP-2500恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏有限公司；KDT-1000凱氏定氮儀：蘇州天威儀器有限公司；DS-1高速搗碎機(jī)：北京中慧天誠(chéng)科技有限公司；S20K酸度計(jì)：梅特勒-托利多集團(tuán)；SH-3010B數(shù)顯恒溫水浴鍋：河北精威試驗(yàn)儀器有限公司；TD5A-WS低速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

內(nèi)臟→攪碎→調(diào)節(jié)固液比（1∶1）→調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶→冷卻→離心去渣→水解液→測(cè)氨基態(tài)氮得率

1.2.2 測(cè)定及分析方法

1.2.2.1 總氮的測(cè)定

凱氏定氮法。

1.2.2.2 氨基態(tài)氮的測(cè)定

由于酶解液有較深的顏色，所以采用電位滴定法[3]。氨基酸得率按以下公式計(jì)算：

式中：N1為水解液中氨基態(tài)氮含量，g；N2為原料中粗蛋白含量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶及其用量的選擇

根據(jù)劉春娥、林洪等的報(bào)道[4]，本項(xiàng)目采用3種單一酶，即木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，并將它們按1∶1的配比兩兩組合，制成6組不同的蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。在各種酶最適宜酶解條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同復(fù)合酶對(duì)水解程度的影響Fig.1 Hydrolysis effect of different compound-protease

從圖1可以看出：復(fù)合酶水解效果均強(qiáng)于單一酶，且堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶組合的酶解效果最佳，酶解液中氨基態(tài)氮得率為70.9%；同時(shí)可以看出，當(dāng)酶用量在0.5%～0.6%之間時(shí)，增加酶的用量對(duì)酶解液中氨基態(tài)氮得率無(wú)明顯影響，因此選擇復(fù)合蛋白酶用量在0.5%左右。

2.2 復(fù)合酶的不同配比對(duì)酶解效果的影響

保持復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶）總添加量為0.5%不變，改變復(fù)合酶配比，設(shè)定酶反應(yīng)pH為8.0，酶反應(yīng)溫度55℃，酶反應(yīng)時(shí)間6 h，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同配比的復(fù)合酶對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Hydrolysis effect of compound-protease on different ratio

由圖2可知，復(fù)合蛋白酶在堿性蛋白酶:木瓜蛋白酶＝2∶1的酶解條件下酶解效果最好，酶解后氨基態(tài)氮得率為71.6%。因此，選擇2∶1為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳配比。

2.3 不同溫度對(duì)酶解效果的影響

保持復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=2∶1）總添加量為0.5%不變，設(shè)定酶解pH為8.0，酶解時(shí)間6 h，分別在 45、50、55、60、65、70 ℃下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合蛋白酶在不同溫度下的酶解效果Fig.3 Hydrolysis effect of compound-protease at different temperature

由圖3可知，在一定條件下，酶解得率隨著溫度的升高而加大，在55℃時(shí)，酶解液氨基態(tài)氮得率為70.8%，達(dá)到最高。超過(guò)55℃，隨著溫度的升高，酶開(kāi)始失活，氨基態(tài)氮得率下降。因此，選擇55℃作為復(fù)合蛋白酶的最適酶解溫度。

2.4 不同時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

保持復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=2∶1）總添加量為0.5%不變，設(shè)定酶反應(yīng)pH為8.0，酶反應(yīng)溫度 55 ℃，分別酶解 5、5.5、6、6.5、7 h，結(jié)果見(jiàn)圖 4，可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基態(tài)氮得率增加。當(dāng)時(shí)間為6 h后，增加趨于平緩，原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，底物濃度降低，酶活力下降所致。因此，選擇酶解時(shí)間以6 h為宜。

圖4 復(fù)合蛋白酶在不同酶解時(shí)間下的酶解效果Fig.4 Hydrolysis effect of compound-protease under different hydrolysis time

2.5 不同起始pH對(duì)酶解效果的影響

保持復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=2∶1）總添加量為0.5%不變，設(shè)定酶解溫度55℃，酶解時(shí)間6 h，分別在起始 pH 為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 復(fù)合蛋白酶在不同酶解pH下的酶解效果Fig.5 Hydrolysis effect of compound-protease under different hydrolysis pH

由圖5知，pH在8～9時(shí)，酶解效果最佳，但是隨著pH的進(jìn)一步增大，氨基態(tài)氮得率下降，說(shuō)明強(qiáng)堿性環(huán)境不利于復(fù)合酶的進(jìn)一步酶解。因此，酶解最適起始pH在8.5左右。

2.6 酶解工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用酶解時(shí)間、酶解溫度、復(fù)合酶配比、起始pH作為4個(gè)因素，以氨基態(tài)氮得率為指標(biāo)進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，優(yōu)化黃花魚(yú)內(nèi)臟酶解工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，比較各列的極差結(jié)果R值，可以發(fā)現(xiàn)RA>RB>RD>RC，即在試驗(yàn)所設(shè)定的因素中，A（復(fù)合酶配比）對(duì)復(fù)合酶酶解的影響最大，其次是B（酶解溫度），D（酶解時(shí)間），C（pH）的影響最小，通過(guò)對(duì) K值的比較，可知A3B3C1D3為最優(yōu)水平。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果再進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，在所選取的4個(gè)因素中，對(duì)酶解效果影響的主次順序?yàn)椋篈>B>D>C，即復(fù)合酶配比＞酶解溫度＞水解時(shí)間>pH。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)表明，因素 A 顯著（0.01<α<0.05），因素 B 顯著（0.01<α<0.05），因素 C 不顯著（α>0.05），因素 D 顯著（0.01<α<0.05），說(shuō)明復(fù)合酶配比、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響顯著，而起始pH對(duì)其影響不顯著。方差分析得到酶解最佳工藝條件為A3B3C1D3，此條件下氨基態(tài)氮得率為72.3%，但直觀分析最佳工藝條件為A3B3C1D2，通過(guò)驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn)，得到堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為2∶1、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.5 h、pH為8。

表1 復(fù)合蛋白酶最佳酶解條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results under the optimalconditions of compound-protease

表2 復(fù)合蛋白酶最佳酶解條件方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結(jié)論

酶的種類及其復(fù)合配比、酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮得率的影響較顯著，酶解的最佳工藝參數(shù)為：堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶比例為2∶1、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間6.5 h、pH為8，在此條件下氨基態(tài)氮得率達(dá)72%以上。

[1]汪寶樹(shù).春末吃黃花魚(yú)味正鮮[J].現(xiàn)代養(yǎng)生,2003(4):15

[2]馬衛(wèi)平,陳曉海,王輝東,等.黃花魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)保健功能[J].肉品衛(wèi)生,1999(3):31

[3]林祖申.醬油生產(chǎn)技術(shù)問(wèn)答[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2000:103

[4]劉春娥,林洪,曹立民,等.魷魚(yú)內(nèi)臟蛋白質(zhì)酶解工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2004,25(9):83-8