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      牛奶中煙酸本底含量的測(cè)定

      2012-12-03 05:45:16劉志楠李海礁宋曉東葉峰喻東威解鑫
      食品研究與開(kāi)發(fā) 2012年10期
      關(guān)鍵詞:煙酰胺煙酸色譜法

      劉志楠,李海礁,宋曉東,葉峰,喻東威,解鑫

      (內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司質(zhì)量安全管理中心分析中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500)

      牛奶是天然的全營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其微量元素的含量比較全面。早在1867年人們就在實(shí)驗(yàn)室中合成了煙酸,而其真正得到發(fā)展是始于20世紀(jì)30年代,1937年C.A.Elvehijiem等分離出煙酸,不久又在肝臟中獲得煙酞胺[1],一時(shí)間作為醫(yī)藥產(chǎn)品得到了迅速發(fā)展,新的用途被不斷的開(kāi)發(fā)出來(lái),其應(yīng)用領(lǐng)域筱蓋醫(yī)藥、食品、飼料添加劑及化工助劑等行業(yè)。煙酸即3—毗吮甲酸,又名尼可丁酸,是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)最穩(wěn)定的一種維生素,是人體和動(dòng)物中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分,它參與組織的氧化還原過(guò)程,具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和擴(kuò)張血管的功能,能促進(jìn)人體和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。煙酸不僅參與細(xì)胞內(nèi)呼吸過(guò)程而且在VB6、泛酸和生物素的存在下還參與脂肪蛋白質(zhì)和DNA的合成[4-5],因此煙酸對(duì)人體有著重要的生理功能[6]。

      關(guān)于水溶性維生素的檢測(cè),以往文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要包括微生物、高效液相法、酶法和免疫法等[7-8],依據(jù)國(guó)標(biāo)的方法,我們采用高效液相色譜法和微生物法對(duì)牛奶中的煙酸進(jìn)行檢測(cè)。但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)牛奶中煙酸本底含量的相關(guān)報(bào)道卻很少。針對(duì)這種現(xiàn)象,我們選取410份中國(guó)各地的牛奶樣本進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn),意在得出牛奶中煙酸含量的大致范圍,以指導(dǎo)乳制品企業(yè)在合理范圍內(nèi)強(qiáng)化煙酸的添加量。本研究參考了AOAC[9]的方法,并使用煙酸檢測(cè)試劑盒[10]使微生物檢測(cè)煙酸的方法有較大程度的優(yōu)化,使檢測(cè)時(shí)間有較大幅度的縮短。

      為了評(píng)價(jià)食品標(biāo)簽上標(biāo)注成分的準(zhǔn)確性。美國(guó)食品和藥物管理局FDA規(guī)定維生素在食品中的實(shí)際添加量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量的100%或更多,而原生維生素產(chǎn)品中的維生素含量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量80%或更多。European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規(guī),用于檢測(cè)添加過(guò)維生素的食品中標(biāo)注的維生素含量[11]。2010年我國(guó)針對(duì)乳制品食品安全體系存在的一些列問(wèn)題作出了相應(yīng)的規(guī)定,出臺(tái)了最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)乳品中各種營(yíng)養(yǎng)素的國(guó)家強(qiáng)制性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),國(guó)標(biāo)GB5413-2010[12]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》對(duì)嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測(cè)方法、檢測(cè)限度、適用范圍等都做了明確的規(guī)定。作為乳品企業(yè)而言,產(chǎn)品必須符合國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)才可以出廠,其次了解煙酸的大致范圍可以給企業(yè)帶來(lái)新的利潤(rùn)增長(zhǎng)點(diǎn)。

      牛奶屬于動(dòng)物源性食品,牛奶中煙酸的含量受飼料、季節(jié)、環(huán)境、種群和牛個(gè)體差異的影響較大,所以數(shù)據(jù)會(huì)在一定的范圍內(nèi)浮動(dòng)。

      1 材料與方法

      1.1 高效液相色譜法

      1.1.1 材料

      中國(guó)各地的牛奶樣本。

      1.1.2 試劑及設(shè)備

      淀粉酶:酶活力≥25 nkat/mg;鹽酸;氫氧化鈉;鹽酸(2.4 mol/L):準(zhǔn)確移取10 mL鹽酸于50 mL容量瓶中,用水定容;氫氧化鈉溶液(2.5 mol/L):稱(chēng)取5.0 g氫氧化鈉于50 mL容量瓶中,用水定容;高氯酸(HClO4):體積分?jǐn)?shù)為60%;甲醇(CH4O):色譜純;異丙醇(C3H8O):色譜純;庚烷磺酸鈉(C7H15NaO3S):優(yōu)級(jí)純。

      U3000高效液相色譜儀(帶紫外檢測(cè)器):美國(guó)UltiMate;pH計(jì)(精度為0.01,型號(hào)為S40+電導(dǎo)率模塊)、天平(感量為 0.1 mg,型號(hào)為 XS204):瑞士mettler;E100H超聲波振蕩器:Elmasonic;培養(yǎng)箱(30℃~80℃,型號(hào)為Frioce11222):德國(guó)MMM。

      1.1.3 方法

      試樣經(jīng)熱水提取、酸性沉淀蛋白質(zhì)后,以C18色譜柱分離,用紫外檢測(cè)器定量。

      1.1.4 前處理

      稱(chēng)取混合均勻固體試樣約5.0 g(精確到0.0001 g)加入約25 mL 45℃~50℃的水,或稱(chēng)取混合均勻液體試樣約20.0 g(精確到0.0001 g)于150 mL錐形瓶中,振搖,靜置5 min~10 min,充分溶解,并冷卻至室溫。將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min。

      1.1.5 測(cè)定液的制備

      待試樣溶液降至室溫后,用鹽酸調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1,放置約2 min后,再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1。將試樣溶液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中,用水反復(fù)沖洗錐形瓶,洗液合并于50 mL容量瓶中,用水定容至刻度,混勻后經(jīng)濾紙過(guò)濾,濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜加壓過(guò)濾,用試管收集,即為試樣待測(cè)液。

      1.1.6 參考色譜條件

      色譜柱:C18柱(粒徑 5 μm,150 mm×4.6 mm)或具有同等性能的色譜柱。

      流動(dòng)相:甲醇70mL,異丙醇20mL,庚烷磺酸鈉1g,用910mL水溶解并混勻后,用高氯酸調(diào)pH至2.1±0.1,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾。

      流速:1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):261 nm。柱溫:25℃。進(jìn)樣量:10 μL。

      1.1.7 標(biāo)準(zhǔn)品配制

      煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 mg/mL):稱(chēng)取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g(精確到0.0001 g),分別置于100 mL容量瓶中,用水溶解定容。

      煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(40μg/mL):分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 mL至50 mL定量瓶中,用水定容,臨用前配制。煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定液:分別準(zhǔn)確吸取煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 0.0、1.0、2.0、5.0、10.0 mL,至 50 mL 容量瓶中用水定容。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.00、0.80、1.60、4.00、8.00μg/mL。臨用前配制。

      1.1.8 試樣溶液的測(cè)定

      將試樣待測(cè)液進(jìn)行色譜測(cè)定。記錄各組分色譜峰面積或峰高,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣待測(cè)液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。

      1.2 微生物法

      1.2.1 材料

      中國(guó)各地的牛奶樣本。

      1.2.2 試劑及設(shè)備

      煙酸檢測(cè)試劑盒:德國(guó)ifp公司;Elx808酶標(biāo)儀(630 nm):美國(guó)Biotek;AIR TECH超凈臺(tái):蘇州安泰公司;微量可調(diào)移液器(100μL~1000μL、20μL~200μL):德國(guó) Eppendorf;一次性無(wú)菌濾膜(0.2 μm~0.22 μm);5 mL一次性無(wú)菌注射器;15 mL無(wú)菌離心管;1.5 mL~2.0 mL無(wú)菌離心管。

      1.2.3 菌種

      植物乳酸桿菌 Lactobacillus plantarum(ATCC 8014)。

      1.2.4 方法

      某些菌體生長(zhǎng)對(duì)某種特定維生素具有較強(qiáng)的依賴(lài)性。配制選擇性的培養(yǎng)基,即含有菌體生長(zhǎng)除待測(cè)維生素以外的所有營(yíng)養(yǎng)元素,待測(cè)維生素添加的多少直接影響菌體的生長(zhǎng)情況。通過(guò)添加不同濃度的待檢測(cè)維生素作為標(biāo)注曲線,就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量,最后通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)的濁度顯示出來(lái),因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過(guò)測(cè)定的濁度來(lái)得出樣品中的煙酸含量[13]。

      1.2.5 前處理

      取1 mL樣品至50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入雙蒸水39 mL,漩渦混勻。在超凈臺(tái)中用 0.2 μm~0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾至1.5 mL~2.0 mL無(wú)菌心管中。

      1.2.6 培養(yǎng)基制備

      加入10 mL無(wú)菌水至維生素培養(yǎng)基中,蓋好瓶蓋,搖勻。在90℃~100℃水浴中加熱5 min以上,其間振蕩至少2次,迅速冷卻至室溫(低于30℃)。使用0.2 μm~0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基至15 mL無(wú)菌離心管中。

      1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)品配制

      煙酸標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌水配置成不同的濃度梯度(0、0.016、0.032、0.064、0.096、0.160 mg/100 g),在 630 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.2.8 檢測(cè)步驟

      將菌體包被于微孔中,取出需要數(shù)量的微孔板條并在板上固定,未使用的微孔板條立即放回原來(lái)的箔袋中,并與干燥劑一起重新封好,儲(chǔ)存在2℃~8℃條件下;用移液器吸取150 μL待檢維生素培養(yǎng)基至微孔中;用移液器吸取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品至指定的微孔中;用粘合箔蓋住微孔條或微孔;在(37±1)℃黑暗條件下孵育44 h~48 h。

      1.2.9 測(cè)量及計(jì)算

      將微孔板漩渦混勻,用酶標(biāo)儀630 nm條件下讀取濁度。使用維生素專(zhuān)用軟件進(jìn)行計(jì)算(4P法)。

      2 結(jié)果

      2.1 煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和色譜圖

      微生物法煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖1;高效液相色譜法,見(jiàn)圖2。

      圖1微生物法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均為1.000,效果較好。圖2高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)品峰值和峰形較好。

      2.2 不同方法檢測(cè)煙酸數(shù)據(jù)對(duì)比情況

      選取10組樣本進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),微生物法和高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中煙酸的STD、RSD和CV值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

      表1結(jié)果顯示:微生物法和高效液相色譜法檢測(cè)牛奶中煙酸數(shù)值的CV值都在10%的范圍內(nèi),相當(dāng)于國(guó)標(biāo)要求的檢測(cè)2個(gè)平行樣品之間的數(shù)值要求范圍,可見(jiàn)2種方法的結(jié)果是一致的,因此我們可以采用一種方法(微生物法)進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)。

      圖1 微生物法煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Microbiological assay of nicotinic acid standard curve

      圖2 高效液相色譜法Fig.2 HPLC method

      表1 不同方法檢測(cè)煙酸的統(tǒng)計(jì)數(shù)值Table 1 Different methods for the detection of niacin statistics

      2.3 煙酸回收率的測(cè)定

      選取的20組樣本作回收率抽樣統(tǒng)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2。

      由表2可見(jiàn),微生物法回收率在79.5%~112.5%之間,檢測(cè)的結(jié)果符合回收率的要求。

      2.4 煙酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定

      選取的20組樣本,同一樣品做平行樣檢測(cè),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差抽樣統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

      表2 煙酸回收率的測(cè)定結(jié)果Table 2 Nicotinic acid recovery measurement results

      表3 煙酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定結(jié)果Table 3 Nicotinic acid and relative standard deviations of deter mination results

      由表3可見(jiàn):微生物法檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%~9.9%之間,檢測(cè)的結(jié)果較好。

      2.5 煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定

      煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定,見(jiàn)表4;煙酸的測(cè)定范圍和煙酸含量正態(tài)分布圖,見(jiàn)圖3和圖4。

      表4 煙酸大量數(shù)據(jù)的測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of determination of niacin to large amounts of data

      圖3 煙酸的測(cè)定范圍Fig.3 Determination of niacin range

      圖4 煙酸含量正態(tài)分布圖Fig.4 Nicotinic acid content of normal distribution

      由表4、圖3和圖4可見(jiàn):410組煙酸數(shù)據(jù)平均值為 87μg/100 mL,數(shù)據(jù)范圍在 36μg/100 mL~138μg/100mL。牛奶中煙酸含量大部分在70μg/100mL~120μg/100 mL之間。

      3 結(jié)論與討論

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:微生物法和高效液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果一致。另對(duì)微生物法檢測(cè)煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行統(tǒng)計(jì),檢測(cè)結(jié)果都很好,另外高效液相色譜法因其檢測(cè)速度較慢、成本較高,所以我們采用微生物法進(jìn)行大量樣本的測(cè)定。

      微生物法對(duì)410組牛奶樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:煙酸平均值為87μg/100 mL,數(shù)據(jù)范圍在36μg/100 mL~138μg/100 mL之間。牛奶中煙酸含量大部分在 70μg/100 mL~120μg/100 mL 之間。

      煙酸性質(zhì)比較穩(wěn)定,在沒(méi)有菌體污染的情況下?lián)p失較少。作為乳制品企業(yè)可以根據(jù)牛奶中煙酸的本底含量,適量添加煙酸即可以達(dá)到要求。

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