序貫設(shè)計(jì)優(yōu)化大豆多肽制備工藝

潘進(jìn)權(quán)，花偉誠(chéng)，劉燕梅，梁玉嫦

（湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

大豆多肽是指大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解作用后，得到的低聚肽混合物。由于經(jīng)過了蛋白酶的水解作用，大豆多肽的溶解性、黏度、乳化力、起泡力等食品加工特性均明顯優(yōu)于大豆蛋白，具有更廣泛的應(yīng)用[1-2]。例如，大豆多肽分子量小，水溶性很高，因此，它作為食品原料，具有低黏度、速溶、無(wú)殘?jiān)忍攸c(diǎn)；由于大豆多肽加熱不產(chǎn)生凝固現(xiàn)象，在pH 4.3（大豆蛋白等電點(diǎn)）下不產(chǎn)生沉淀，黏度隨濃度升高變化不大，可開發(fā)蛋白飲料和高蛋白果凍。此外，眾多的研究發(fā)現(xiàn)，大豆多肽具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血壓、減肥等多種生理功能[3]。因此，大豆多肽作為一種新型的功能性食品原料具有很好的開發(fā)潛力。

從已有文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，在大豆蛋白水解制備多肽的工藝中，應(yīng)用堿性蛋白酶的效果明顯優(yōu)于中性或酸性蛋白酶，這應(yīng)該與大豆蛋白在堿性條件下可溶的特點(diǎn)有一定的關(guān)系[4-5]。然而，在蛋白水解過程中，隨著肽鍵的打開，水解液的pH會(huì)有所下降，堿性蛋白酶的活性將降低，大豆蛋白的溶解度也會(huì)下降從而限制了大豆蛋白的水解[5]。為了維持水解液的pH穩(wěn)定，使其有利于酶的作用及蛋白水解，在以往的工藝中，都會(huì)連續(xù)加堿來(lái)控制體系的pH，甚至是采用pH緩沖劑的方法。這樣雖然可以在一定程度上提高蛋白水解效率，但是在水解液中會(huì)殘留大量的無(wú)機(jī)鹽。為了產(chǎn)品的使用安全，在產(chǎn)品的下游處理過程中必須增加繁瑣的脫鹽工序。這在很大程度上增加了產(chǎn)品的成本。鑒于此，本文考察了在沒有外加堿的pH漸變條件下，大豆蛋白的水解過程，擬建立一種新的大豆多肽制備工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)含量99%）購(gòu)自萊州福客生物技術(shù)公司，Alcalase蛋白酶購(gòu)自諾維信公司，試驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

B-260型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；AUY120型電子天平：日本島津；723N型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-18型真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆多肽制備基本流程

1.3.2 蛋白酶活性的測(cè)定

采用Folin酚法[6]：1.5 mL離心管中加入0.3 mL適當(dāng)稀釋的酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白（溶于0.05 mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液），40℃反應(yīng)10 min，加0.6 mL 0.4mo1/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置15min后14000g離心10 min，取上清液0.6 mL，加入3 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液及0.6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測(cè)定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活單位。

酶活定義：試驗(yàn)條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當(dāng)量酪氨酸所需的酶量為1個(gè)活力單位。

1.3.3 水解度的測(cè)定

大豆蛋白水解度值采用氨基酸態(tài)氮含量來(lái)表示，用茚三酮顯色的方法來(lái)測(cè)定[7]。取適當(dāng)稀釋后的蛋白水解液0.40 mL于試管中并加入1.60 mL蒸餾水和1.00mL茚三酮顯色劑混勻后置于沸水浴中加熱15min。冷卻后加入5.00 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15 min，同時(shí)作試劑空白。以試劑空白為參比于570 nm測(cè)定樣品顯色液的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物）計(jì)算蛋白水解液中氨基酸態(tài)氮的含量（mg/mL）。由此計(jì)算出樣品的水解度：

式中：DH為樣品的水解度值，（mg/100 g）；C為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得的測(cè)試樣中氨基酸態(tài)氮的濃度，（mg/mL）；n為蛋白水解液的稀釋倍數(shù)；m為水解前樣品中蛋白的濃度，（g/mL）。

1.3.4 多肽得率計(jì)算

式中：m為水解液經(jīng)冷凍干燥后的質(zhì)量，g；w為水解液中原大豆蛋白的質(zhì)量，g。

1.3.5 大豆蛋白的水解

用蒸餾水配制濃度5%的大豆蛋白，并調(diào)節(jié)pH到9.0，然后置于沸水浴中熱處理15 min。冷卻后按照酶與底物比2000kat/g加入Alcalase蛋白酶，置于50℃下保溫酶解5 h。酶解結(jié)束后調(diào)節(jié)水解液的pH到5.0并煮沸滅酶5 min，于5000 r/min離心10 min，所得上清即為蛋白水解液。以上是大豆蛋白水解的基本方法，試驗(yàn)過程中將根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案對(duì)其中相關(guān)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

蛋白濃度對(duì)水解度的影響：用蒸餾水分別配制不同濃度（1%～8%）的大豆蛋白溶液，然后按照1.3.5的方法進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定各水解液的水解度。

起始pH對(duì)水解度的影響：用蒸餾水配制濃度5%的大豆蛋白，并分別調(diào)節(jié)其pH到8.0～12.0的范圍，然后按照1.3.5的方法進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定各水解液的水解度。

酶解溫度對(duì)水解度的影響：按照1.3.5的方法分別在不同的溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）下進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定各水解液的水解度。

加酶量對(duì)水解度的影響：按照1.2.4的方法，分別以不同的酶與底物比（750、1000、1500、2000、3000、4000、5000 kat/g）加入不同量的Alcalase蛋白酶，進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定各水解液的水解度。

水解時(shí)間對(duì)水解度的影響：按照1.3.5的方法進(jìn)行水解試驗(yàn)，測(cè)定不同水解時(shí)間水解液的水解度。

1.3.7 部分析因設(shè)計(jì)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果可初步確定水解工藝中各單一因素的合適取值范圍。在此取值范圍內(nèi)，利用minitab統(tǒng)計(jì)軟件，采用其中的2水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)上述各因素做進(jìn)一步的分析，由此確定它們對(duì)大豆蛋白水解影響的顯著程度，并初步考察各因素間的交互作用。

1.3.8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，采用響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)[8]，對(duì)部分析因設(shè)計(jì)中篩選的顯著因素做進(jìn)一步考察，以確定其最合適的取值，并由此確定大豆蛋白水解的最佳工藝條件。

1.3.9 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)采用序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9]，其基本思路就是將多種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，包括單因素試驗(yàn)、部分析因設(shè)計(jì)，爬坡設(shè)計(jì)及中心組合設(shè)計(jì)有序的結(jié)合起來(lái)。首先，采用單因素試驗(yàn)初步考察對(duì)結(jié)果有影響的因素，并確定各因素的合適取值范圍；然后通過部分析因設(shè)計(jì)篩選對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素，并利用爬坡設(shè)計(jì)尋求合適的試驗(yàn)空間（以確保在該試驗(yàn)空間中存在最大響應(yīng)或最小響應(yīng)點(diǎn)），最后通過中心組合設(shè)計(jì)以確定在該試驗(yàn)空間的最大或最小響應(yīng)點(diǎn)（即確定最佳試驗(yàn)條件）。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析采用miniTAB 14和SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)的方法初步考察了起始pH、溫度、水解時(shí)間、加酶量、大豆蛋白濃度對(duì)水解度的影響。結(jié)果（圖表未列出）表明：以上各因素對(duì)于Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白均有一定的影響，在不同的條件下進(jìn)行水解試驗(yàn)大豆蛋白的水解效率有所差異。相對(duì)而言，水解試驗(yàn)在 pH 10.0～11.0、溫度 50℃～55℃、大豆蛋白濃度5%～6%、加酶量2000 kat/g～3000 kat/g蛋白、水解時(shí)間5 h～7 h，大豆蛋白的水解效果較好。

2.2 部分析因設(shè)計(jì)

采用部分析因設(shè)計(jì)的方法對(duì)單因素試驗(yàn)中考察的因素做了進(jìn)一步的分析，以此確定各因素對(duì)大豆蛋白水解的影響程度，以及各因素間的交互作用。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了部分析因設(shè)計(jì)各因素的水平，表1、2及表3分別給出了部分析因設(shè)計(jì)的因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及結(jié)果的回歸分析。

表1 部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of fractional factorial design

從表3的分析結(jié)果可以看出：考察的5個(gè)因素對(duì)大豆蛋白水解的影響程度有明顯的差異；其中大豆蛋白濃度（D），酶與底物蛋白比（E）對(duì)大豆蛋白的水解有極顯著的影響（p＜0.01）；水解溫度（C）對(duì)大豆蛋白水解有顯著的影響（p＜0.05）；起始pH及水解時(shí)間對(duì)大豆蛋白水解的影響不顯著（p＞0.1）；另外，A·C、A·E、B·C、B·D及C·E的交互作用對(duì)大豆蛋白水解也有顯著的影響。試驗(yàn)結(jié)果的曲率分析顯示，部分析因設(shè)計(jì)確定的試驗(yàn)空間是一極顯著曲面響應(yīng)（Ct Pt＝0.000＜0.01），其中必存在最大或最小響應(yīng)點(diǎn)。為了確定此試驗(yàn)空間內(nèi)的極值響應(yīng)點(diǎn)，后續(xù)的試驗(yàn)將以因素D及E為對(duì)象，在表1所示的各因素水平的取值范圍內(nèi)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面分析，在此同時(shí)固定因素A、B和C的取值為中水平。

2.3 中心組合設(shè)計(jì)

在以上部分析因試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了大豆蛋白濃度（D），酶與底物蛋白比（E）兩者的相互作用及對(duì)大豆蛋白水解的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表2 部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of fractional factorial design

表3 部分析因試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table 3 Regression analysis of fractional factorial design

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of central composite design

對(duì)表4的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，可以擬合得到以下數(shù)學(xué)模型：

分析表明，回歸模型具有極高的顯著性（p=0.008＜0.01），該模型可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行較好的擬合。圖1、2分別給出了擬合模型的響應(yīng)曲面及等高線圖，曲面的形狀及相應(yīng)的等高線圖說(shuō)明在所選取的試驗(yàn)空間中存在最大響應(yīng)值。利用SAS軟件分析確定了該最大響應(yīng)值為（39.10±0.78）mg/100 g，其對(duì)應(yīng)的因素取值分別為：大豆蛋白濃度4.92%、酶與底物蛋白比為2758kat/g蛋白、溫度55℃、起始pH11.0、水解時(shí)間7h。

圖1 響應(yīng)面圖:因素D與E對(duì)大豆蛋白水解的影響Fig.1 Response surface:effects of factor D and E on hydrolysis of soy protein

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行大豆蛋白水解試驗(yàn)，將蛋白水解液進(jìn)行冷凍干燥，測(cè)定了多肽的得率。結(jié)果顯示，在優(yōu)化條件下進(jìn)行的大豆蛋白水解，其多肽的得率可達(dá)63.21%。

圖2 等高線圖：因素D與E對(duì)大豆蛋白水解的影響Fig.2 Contour map:effects of factor D and E on hydrolysis of soy protein

3 結(jié)論

采用序貫設(shè)計(jì)的方法對(duì)pH漸變條件下Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白制備多肽的工藝進(jìn)行了探討：首先采用單因素試驗(yàn)考察了底物濃度、起始pH、溫度、酶濃度、酶解時(shí)間對(duì)大豆蛋白水解的影響，初步確定了各因素的合適取值范圍；在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了部分析因試驗(yàn)，進(jìn)一步分析了以上各因素對(duì)大豆蛋白水解影響的顯著程度，并篩選出顯著性影響因子；最后采用中心組合設(shè)計(jì)的方法對(duì)篩選的因素進(jìn)行了考察，并由此確定了最佳的酶解工藝條件：大豆蛋白濃度4.92%、酶與底物蛋白比為2758 kat/g蛋白、溫度55℃、起始pH 11.0、水解時(shí)間7 h。在優(yōu)化的工藝條件下進(jìn)行了大豆蛋白水解，大豆蛋白的水解度可以達(dá)到39.10 mg/100 g，多肽得率為63.21%。這一結(jié)果雖說(shuō)略低于同類文獻(xiàn)報(bào)道[10]，但是由于該工藝所得產(chǎn)品基本上不需要進(jìn)行后續(xù)的脫鹽處理，工藝更為簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本可能會(huì)更低。綜合來(lái)看，在pH漸變條件下，采用堿性蛋白酶酶解制備大豆多肽具有可行性。

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