水葫蘆總黃酮最佳提取工藝的研究

陸廣匯

（江蘇省建湖縣人民醫(yī)院，建湖224700）

水葫蘆 （Water Hyacinth），屬雨久花科、鳳眼蓮屬［1］。原產(chǎn)南美，1884年作為觀賞植物被帶到美國的一個(gè)園藝博覽會(huì)上，當(dāng)時(shí)被預(yù)言為 “美化世界的淡紫色花冠”。1901年，水葫蘆被引入中國，已成為中國危害嚴(yán)重的外侵植物?，F(xiàn)在這種植物已成為我國大部分境內(nèi)迅速擴(kuò)散傳播的惡性雜草［2］。水葫蘆包含的主要成分有皂苷、揮發(fā)油和黃酮等，其乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力，在諸多類型天然抗氧化劑中［3］，黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化等作用。為了綜合利用水葫蘆，使它變廢為寶［4］，我們用植物類黃酮的獨(dú)特優(yōu)勢，確定水葫蘆總黃酮的最佳提取工藝，為后續(xù)開辟安全、無副作用的綠色化妝品提供便利［5］。

1 水葫蘆提取工藝研究

1.1 材料來源及處理 干燥水葫蘆打粉過40目篩備用［6］。

1.2 正交實(shí)驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)及總黃酮的提取 表頭設(shè)計(jì)見表1，正交實(shí)驗(yàn)見表2。

表1 表頭設(shè)計(jì)

表2 正交實(shí)驗(yàn)表

上述試驗(yàn)藥材加熱回流得到乙醇提取液，揮去乙醇［7］，干燥后得浸膏，稱重 （g），如表3。

表3 浸膏質(zhì)量

1.3 紫外法分光光度法 （UV）測定樣品中總黃酮含量

1.3.1 儀器與試劑 752紫外可見分光光度計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；蘆丁對(duì)照品：中國藥品生物制品鑒定所 （100080－200306）；甲醇：色譜純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：分析純；蒸餾水。

1.3.1 溶液配制 （1）5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、1mol／L NaOH溶液。稱取亞硝酸鈉2.5g置50ml燒杯中，加水配制成5%亞硝酸鈉溶液；稱取硝酸鋁5g置50ml燒杯中，加水配制成10%硝酸鋁溶液；稱取NaOH 8g置200ml燒杯中，加水配制成1mol／L NaOH溶液。（2）對(duì)照品溶液配制。精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品50mg置100ml容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱，使蘆丁溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，得0.5mg／ml對(duì)照品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對(duì)照品溶液 （0.5mg／ml）1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml分別置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，充分搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1ml，充分搖勻，放置6mim，加入1mol／L NaOH溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min，于分光光度計(jì)上以第一份溶液為空白，在510nm波長［8］，鎢燈，測定吸光度值A(chǔ)，見表4，以A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y＝11.711X，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991，r＝0.9995。

表4 吸光度值A(chǔ)

1.4 樣品溶液總黃酮含量測定 精密稱取浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，再分別量取5ml置25ml容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)的方法，自 “各加水至6ml”起依法操作，直至測定出樣品的吸光度值［9］，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，見表5。

表5 樣品溶液總黃酮含量測定

1.5 高效液相 （HPLC）測定樣品中蘆丁含量

1.5.1 儀器與試劑 Waters2690高效液相色譜儀，996PDA二極管矩陣檢測器，Millennium32色譜管理系統(tǒng)；蘆丁對(duì)照品：中國藥品生物制品鑒定所 （100080－200306）；甲醇：色譜純；重蒸餾水：自制。

1.5.2 方法與結(jié)果 色譜條件的選擇和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：Alltima C18柱 （4.6×250nm；5μm），柱溫為30℃；以甲醇－0.4%磷酸水 （30：70）為流動(dòng)相，流速為1.0ml／min；檢測波長為360nm。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按蘆丁計(jì)算為6130［10］。

1.5.3 溶液的配置 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。樣品溶液的制備：精密稱取水葫蘆浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1ml溶液置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.5.4 方法學(xué)考察 ①外標(biāo)一點(diǎn)法［11］：稱取蘆丁對(duì)照品10mg，精密稱定，加甲醇制成對(duì)照品貯備液，再精密吸取上述對(duì)照品溶液0.8ml，用甲醇定容至5ml，吸取20μl對(duì)照品溶液注入液相色譜儀測定，得到其峰面積4129。②樣品含量測定：分別精密吸取樣品溶液20μl注入高效液相色譜儀測定，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算結(jié)果，見表6。

表6 樣品含量

1.6 浸出物量的測定——冷浸法 精密稱取浸膏4g，置100ml錐形瓶中，精密加70%乙醇，密塞，冷浸，前6小時(shí)內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18小時(shí)，用干燥濾器濾過，取20ml濾液［12］。揮去乙醇，干燥精密稱重 （g），見表7。

表7 浸出物含量

2 結(jié)果

采用SPSS13.0進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2.1 紫外SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表8

表8 總黃酮含量正交結(jié)果

2.2 HPLCSPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表9。

表9 蘆丁含量正交結(jié)果

3 正交加權(quán)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表10。

表10 正交加權(quán)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)紫外、液相、浸出物結(jié)果的加權(quán)，得出最佳提取工藝：70%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次。

5 討論

水葫蘆中含有較為豐富的黃酮類成分［13］，正交試驗(yàn)中影響提取的效率的4個(gè)因素 （乙醇濃度、乙醇體積、提取的時(shí)間、提取的次數(shù)）中提取的時(shí)間和提取的次數(shù)影響較小，而乙醇的濃度影響顯著。因此用7%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次，提取較完全［13］。

水葫蘆乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力，而活性氧與自由基的產(chǎn)生被認(rèn)為與人類的眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在諸多類型天然抗氧化劑中［14］，黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化，預(yù)防和治療多種疾病。通過對(duì)水葫蘆黃酮化合物提取工藝的研究，可以綜合利用水葫蘆，變廢為寶［15］，同時(shí)可以擴(kuò)大藥源，極大的利用資源，具有良好的社會(huì)效益［16－17］。

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