李雪飛，許 倩，許佩龍，謝文強，王洪超，李偉偉，劉 健，李偉彥

(1.南方醫(yī)科大學南京臨床醫(yī)學院，2.南京軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210002)

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞的活化在神經(jīng)病理性疼痛的維持起著重要的作用［1］，但星形膠質(zhì)細胞的活化機制目前仍不清楚?？p隙連接是細胞間直接進行物質(zhì)和信息交換的唯一通道，星形膠質(zhì)細胞之間存在廣泛的縫隙連接［2］，因此有學者提出縫隙連接可能參與了神經(jīng)病理性疼痛時星形膠質(zhì)細胞的活化［3］。甘珀酸(carbenoxolone，CBX)是常用的縫隙連接阻滯劑，本實驗通過單次鞘內(nèi)注射大劑量CBX，觀察其對SNT大鼠損傷側(cè)機械痛敏，以及損傷側(cè)脊髓背角 GFAP和 TNF-α、IL-1β表達的影響，來探討縫隙連接是否參與了神經(jīng)病理性疼痛時星形膠質(zhì)細胞活化。

1 材料與方法

1.1 動物模型 體質(zhì)量160～180 g的成年♂Sprague-Dawley大鼠36只(由南京軍區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，清潔級)，單籠飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)室溫為 (23±3)℃，周期光照8:00～20:00，大鼠自由進食，飲水。所有實驗均在光照期間完成。以2%的戊巴比妥(Sigma公司，美國)50 mg·kg－1腹腔注射麻醉，根據(jù)Kim等的方法［4］創(chuàng)建模型。

1.2 藥物及分組 甘珀酸(Sigma，美國);兔抗大鼠膠原纖維酸性蛋白(anti-glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(Sigma，美國);ELISA試劑盒。所有動物隨機分成3組:假手術(shù)組(Sham組)、生理鹽水組(NS組)、SNT+CBX 5 μg組(CBX 組)。

1.3 鞘內(nèi)注射 參照Mestre等［5］所建立的方法。大鼠麻醉后用連有PE-10導管的稍鈍針頭經(jīng)腰5(L5)和腰4(L4)錐間隙行椎管穿刺，以動物出現(xiàn)突然地側(cè)向甩尾運動作為穿刺成功的標志，鞘內(nèi)注射采用微量進樣器進行。術(shù)后10 d，Sham組和NS組鞘內(nèi)注射 10 μl NS，CBX 組大鼠鞘內(nèi)注射 10 μl CBX，濃度0.5 g·L－1甘珀酸的劑量選擇參考既往文獻。

1.4 機械痛閾的測定 3組大鼠隨機取6只于術(shù)前1 d，術(shù)后 1、3、5、7 d 及術(shù)后 10 d 給藥前，給藥后1、2、4、6 h 測定損傷側(cè)后肢機械痛閾(MWT)。MWT測定:將大鼠分別放置于金屬篩網(wǎng)上的有機玻璃箱里，安靜15 min，以Von Frey纖維垂直刺其左右后肢足底中部皮膚，持續(xù)≤4 s，大鼠出現(xiàn)抬足，舔足，躲避等反應時，記錄Electrovon Frey讀數(shù)器上顯示的最大值(g)，每只老鼠重復測量5次，間隔5 min，去除最大和最小值計算3次的平均值即為大鼠的MWT值。

1.5 免疫組織化學染色 3組大鼠術(shù)后10 d鞘內(nèi)注射CBX 2 h后，分別取3只按以下方法取材檢測。2%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1經(jīng)腹腔注射麻醉，開胸后經(jīng)左心室插管至升主動脈，依次灌注生理鹽水250 ml、4% 多聚甲醛(pH 7.4)400 ml、PBS 緩沖液250 ml約1 h后取大鼠腰膨大脊髓，于上述固定液中固定24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明石蠟包埋，進行連續(xù)切片，片厚40 μm，每個蠟塊連續(xù)切5片。以ABC法作GFAP免疫組化染色。染片用半自動圖像分析儀進行圖像分析，計算各切片損傷側(cè)GFAP陽性細胞數(shù)表示星形膠質(zhì)細胞表達的強度。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉積為GFAP免疫組化陽性反應細胞。

1.6 TNF-α和IL-1β水平檢測 ELISA測定損傷側(cè)脊髓TNF-α和IL-1β濃度。按照試劑盒中說明書操作，并在波長為450 nm，參考波長為620 nm處，用酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定光密度，根據(jù)標準曲線算出TNF-α和IL-1β濃度。

2 結(jié)果

2.1 MWT測定結(jié)果 術(shù)前1 d，3組大鼠MWT差異均無顯著性(P＞0.05)。與術(shù)前相比，Sham組各時間點損傷側(cè)MWT差異無顯著性(P＞0.05)。與Sham 組相比，NS 組和 CBX 組術(shù)后1、3、5、7、10 d 痛閾下降(P＜0.05)。與術(shù)后10 d給藥前1 h相比，NS組給藥后1、2、4、6 h的MWT值差異無顯著性(P＞0.05)。與 NS 組相比，CBX 組術(shù)后1、3、5、7 d 及10 d給藥前MWT與其差異無顯著性(P＞0.05)，但給藥后1、2、4 h損傷側(cè)MWT較給藥前明顯提高(P＜0.05)，但6 h時差異無顯著性(P＞0.05)，見Fig 1。

2.2 GFAP測定結(jié)果 NS組損傷側(cè)脊髓背角GFAP染色較Sham組有明顯的增強，CBX組損傷側(cè)脊髓背角GFAP染色較Sham組略有增強，但較NS組染色明顯減弱(Fig 2)。NS組損傷側(cè)脊髓背角GFAP陽性細胞數(shù)較Sham組均明顯升高(P＜0.05)，CBX組損傷側(cè)脊髓背角GFAP陽性細胞數(shù)較NS組明顯降低(P＜0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Intrathecal administration of CBX affects SNT-induced mechanical allodynia

2.3 TNF-α和IL-1β測定結(jié)果 NS組損傷側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平較Sham組均明顯上升(P＜0.05);CBX組損傷側(cè)脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平較NS組明顯下降(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 The changes of TNF-α and IL-1β in the spinaldorsal horn in the three groups(±s，ng·g－1)

Tab 1 The changes of TNF-α and IL-1β in the spinaldorsal horn in the three groups(±s，ng·g－1)

2 h after intrathecal injection NS and CBX，the expression of TNF-α and IL-1β in the ipsilateral spinal dorsal horn in NS group were significantly increased compared with those in group sham(*P ＜0.05).Compared with group NS，the expression of TNF-α and IL-1β in the spinal dorsal horn in CBX group was significantly decreased(#P ＜0.05).

Group TNF-α IL-1β Sham 9.68 ±2.91 25.73 ±2.73 NS 148.43 ±9.92* 317.30 ±22.97*CBX 69.15 ±9.27*# 140.06 ±19.84*#

3 討論

越來越多的研究證實，神經(jīng)損傷或炎癥后脊髓的小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞相繼活化，通過釋放促炎細胞因子、趨化因子、前列腺素、一氧化氮，或者影響脊髓內(nèi)重要神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的轉(zhuǎn)運平衡［6－7］，導致了痛覺傳遞通路神經(jīng)元的高興奮性，從而誘導和維持了慢性神經(jīng)病理性疼痛，其中星形膠質(zhì)細胞在疼痛的維持中發(fā)揮重要作用。采用非特異性的膠質(zhì)細胞抑制劑如:氟代檸檬酸、丙戊茶堿、米諾環(huán)素、己酮可可堿等，可明顯地緩解神經(jīng)病理性疼痛動物模型的痛覺高敏［8－10］，因此調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細胞，尤其是星形膠質(zhì)細胞的活性是神經(jīng)病理性疼痛研究的一個重要方向。

Fig 2 GFAP expression in the dorsal horn of the spinal cord in rats

Fig 3 Changes of number for astrocytic activation marker GFAP in the rats spinal cord of each group

縫隙連接在星形膠質(zhì)細胞活化中的作用最近被認識?？p隙連接是相鄰細胞膜之間的連接通道，允許離子和小分子例如cAMP、IP3、ATP和小分子肽類在細胞間自由通過［11］。在生理狀態(tài)下，幾乎所有的星形膠質(zhì)細胞都表達縫隙連接蛋白，通過縫隙連接的廣泛偶聯(lián)，眾多的星形膠質(zhì)細胞形成了一種細胞網(wǎng)絡。有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞可對激活的神經(jīng)元細胞做出快速電反應，具體表現(xiàn)為沿縫隙連接傳播的Ca2+波［11］。這是否意味慢性疼痛時，興奮的神經(jīng)元周圍的星型膠質(zhì)細胞通過縫隙連接形成的網(wǎng)絡，使星形膠質(zhì)細胞活化擴散，從而促進了神經(jīng)病理性疼痛的維持。采用縫隙連接的阻滯劑甘珀酸，既往研究探討了縫隙連接在慢性疼痛模型時星形膠質(zhì)細胞活化的作用。Spataro等［12］發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射CBX(CCI)敏，同時還能逆轉(zhuǎn)人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 gp120(gp120)誘導產(chǎn)生的機械痛敏和細胞因子的釋放。Seo等［13］也發(fā)現(xiàn)在FeCl2誘導的缺血性疼痛模型中大鼠脊髓背角GFAP的表達明顯升高，而鞘內(nèi)注射CBX能夠明顯抑制大鼠的機械痛敏。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)SNT大鼠術(shù)后10 d機械痛閾明顯降低，損傷側(cè)脊髓背角GFAP的表達和細胞因子TNF-α、IL-1β的水平也明顯增加，而鞘內(nèi)注射CBX后機械痛閾明顯提高，同時GFAP的表達和細胞因子TNF-α、IL-1β的表達也降低，因此我們推測縫隙連接可能是星形膠質(zhì)細胞活化的一種機制，阻斷縫隙連接可抑制星形膠質(zhì)細胞活化，減少促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的釋放，從而緩解了痛覺高敏。

綜上所述，鞘內(nèi)單次注射5 μg甘珀酸可能明顯緩解SNT大鼠的機械痛覺高敏，該效應可能與甘珀酸阻斷脊髓后角星形膠質(zhì)細胞的縫隙連接，從而抑制了星形膠質(zhì)細胞活化，減少了促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的釋放有關(guān)，本研究提示縫隙連接可能是慢性神經(jīng)病理性疼痛時脊髓后角星形膠質(zhì)細胞活化的一個重要通路。

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