高 鑫， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風(fēng)娟

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

嗜溫乳酸菌與白地霉混合發(fā)酵酸乳的研究

高 鑫， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 李風(fēng)娟

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

與高溫發(fā)酵酸乳相比，嗜溫乳酸菌與霉菌聯(lián)合發(fā)酵酸乳有更豐富的風(fēng)味物質(zhì)，且嗜溫發(fā)酵酸乳粘稠、細(xì)膩，香氣濃郁、純正，酸甜適口.采用編號(hào)為3-7和3-9的嗜溫乳酸菌與1株產(chǎn)香白地霉聯(lián)合發(fā)酵生產(chǎn)酸乳，通過混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到酸乳發(fā)酵劑的優(yōu)化菌種體積配比(乳酸菌3-7∶乳酸菌3-9∶白地霉)為50∶5∶45時(shí)，其風(fēng)味、質(zhì)地和氣味較佳.該酸乳具有很高的有效營養(yǎng)成分，其胞外多糖質(zhì)量濃度高達(dá)643.2 mg/L，具有較高的生理功能.其中白地霉不僅能與乳酸菌互利共生產(chǎn)生真菌胞外多糖，而且其產(chǎn)生的香氣成分還能有效地提高呈香型物質(zhì)的種類和含量，改善酸乳的風(fēng)味質(zhì)量.

嗜溫乳酸菌;白地霉;功能性酸乳;胞外多糖

隨著人們生活水平的不斷提高和健康消費(fèi)觀念的加強(qiáng)，近年來圍繞風(fēng)味優(yōu)良、功能性顯著等方面開發(fā)的酸奶產(chǎn)品愈加受到消費(fèi)者的歡迎［1－2］.目前，國內(nèi)市場(chǎng)上的酸乳產(chǎn)品主要是以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主要菌株發(fā)酵的高溫發(fā)酵酸乳［3］，品種單一，過分依賴增稠劑，乳化劑等食品添加劑來保持酸乳的質(zhì)構(gòu)特性.

嗜溫乳酸菌主要是最適生長溫度介于20～30℃的一類乳酸菌，最常見的是乳球菌和明串珠菌.研究表明，采用嗜溫乳酸菌發(fā)酵的酸乳風(fēng)味柔和，在較低溫度下能產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)［4－5］，產(chǎn)胞外多糖能力更強(qiáng)［6－11］.

白地霉(Geotrichum candidum)是一種常見真菌，屬于半知菌亞門、叢梗孢科、卵形孢霉族、地霉屬［12］.白地霉細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，可供食用及飼用.據(jù)報(bào)道［13－17］，部分白地霉具有突出的產(chǎn)香能力，是一種具有應(yīng)用潛力的工業(yè)微生物，國外普遍用它來生產(chǎn)乳酪［18－20］，國內(nèi)多用食品工業(yè)廢棄物來發(fā)酵生產(chǎn)白地霉，作為菌體蛋白使用.

本研究擬利用篩選的2株嗜溫乳酸菌及1株能夠發(fā)酵牛乳產(chǎn)生胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)的產(chǎn)香白地霉進(jìn)行混合發(fā)酵，在實(shí)驗(yàn)室條件下制備富含胞外多糖的功能性酸乳，確定混合發(fā)酵酸乳的生產(chǎn)工藝并對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià).

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)用4 株乳酸菌(編號(hào)為 3-2，3-3，3-7，3-9)及白地霉均篩自新疆伊犁地區(qū)哈薩克族牧民自制傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品.

1.2 儀器

DV-Ⅲ+型流變儀，美國 Brookfield公司;GC-2010型氣相色譜儀，日本島津公司;4000GC/MS型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國瓦里安公司.

1.3 混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件

本試驗(yàn)中混料試驗(yàn)的設(shè)計(jì)采用Design expert 8.0 軟件［21－22］.

1.4 方法

1.4.1 菌落計(jì)數(shù)

乳酸菌計(jì)數(shù)方法參見文獻(xiàn)［23］，霉菌計(jì)數(shù)方法參見文獻(xiàn)［24］.

1.4.2 EPS提取

用飽和NaOH調(diào)樣液pH值至8.0，4 000 r/min離心15 min，上清液用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6，3 000 r·min－1離心 15 min.調(diào) pH 值至 7.5，加入 1/10 體積的胰酶液(質(zhì)量濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，40℃水浴酶解 2.5 h 后，2 000 r·min－1離心 15 min.加入1/3 體積的 Sevag液振蕩 30 min，3 000 r·min－1離心15 min，去除沉淀，重復(fù)3次.加入3～5倍體積的95%的乙醇，充分振蕩(多糖呈絮狀沉淀析出)，3 000 r·min－1離心 15 min，收集沉淀.洗滌干燥:將沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，真空干燥得粗多糖.

1.4.3 粗多糖純度測(cè)定

采用苯酚－濃硫酸法測(cè)定胞外多糖含量，用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線.準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.12 mL(相當(dāng)于葡萄糖 0.0，50，60，70，80，90，100，120 μg)及各樣品備用液0.1 mL置于10 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)足1.0 mL，分別加入1.0 mL 5.0%苯酚水溶液，搖勻后靜止2 min，迅速加入5 mL濃硫酸，靜止10 min，置于30℃水浴中保溫15 min，取出，置冷水中冷卻，以空白管為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在波長490 nm處測(cè)定光密度.以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算胞外多糖含量.

1.4.4 白地霉揮發(fā)性香氣成分分析

采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)白地霉產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定.氣相色譜條件，色譜柱型號(hào)為 VF-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為 He，99.999%，初始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min，升至150℃，保持1 min，以8℃ /min，升至250℃，保持6 min.質(zhì)譜條件的質(zhì)量分離器為離子阱;離子源為EI;電離能量為70 eV;離子阱溫度為220℃;傳輸線溫度為280℃;溶劑延遲時(shí)間1 min.掃描方式為全掃描;掃描范圍為50～500 m/z;檢索譜庫為NIST05.

2 結(jié)果與分析

2.1 混料試驗(yàn)對(duì)菌種比例的確定

發(fā)酵酸乳在一般情況下，接種量是一定的，最終發(fā)酵乳的產(chǎn)品特征指標(biāo)與接種菌株比例有關(guān).因此，混料回歸設(shè)計(jì)比較適合本實(shí)驗(yàn)中菌種配比的研究.利用Design expert 8.0軟件進(jìn)行混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)，初始參數(shù)設(shè)置見表1，軟件生成的混料試驗(yàn)見表2.

表1 混料試驗(yàn)參數(shù)設(shè)定Tab.1 Parameters of mixture design

表2 混料試驗(yàn)Tab.2 Mixture design

通過Design Expert 8.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件，通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，軟件預(yù)測(cè)了優(yōu)化后的菌種比例，并通過試驗(yàn)對(duì)此比例進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定采用2株乳酸菌(3-7和3-9)與白地霉按體積比50∶5∶45的比例(總接種量按5%接種)進(jìn)行接種，在該條件下，發(fā)酵乳在質(zhì)地及風(fēng)味上都優(yōu)于其他配比.經(jīng)鑒定，菌株3-7為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus Lactis subsp.lactis)，菌株3-9為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus Lactis subsp.cremaris).

前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，乳酸菌3-7單菌發(fā)酵酸乳具有較好的風(fēng)味，乳酸菌3-9單菌發(fā)酵酸乳具有較好的質(zhì)地，且乳酸菌3-9是高產(chǎn)EPS菌株.白地霉除具有優(yōu)良的產(chǎn)香特性外，也具有很高的產(chǎn)EPS能力.從最終優(yōu)化的菌種配比中可以看出，只需較少量乳酸菌3-9即可使酸乳具有很好的凝乳效果，很少量白地霉即可改善發(fā)酵乳的氣味.

2.2 乳酸菌、霉菌聯(lián)合發(fā)酵酸乳工藝

2.2.1 聯(lián)合發(fā)酵酸乳工藝

乳酸菌3-7→30℃活化24 h→接種于5 mL無菌脫脂乳→約10 h凝乳;乳酸菌3-9→30℃活化24 h→接種于5 mL無菌脫脂乳→約6 h凝乳;白地霉→孢子懸浮液→接種于5 mL無菌脫脂乳→30℃，200 r·min－1，48 h;乳酸菌 3-7、乳酸菌 3-9 和白地霉以體積比50∶5∶45，按接種量5%接種于無菌全脂牛乳中，30℃培養(yǎng)12 h，4℃后發(fā)酵8 h，即得到產(chǎn)品.

2.2.2 菌落計(jì)數(shù)

為保證試驗(yàn)的可重復(fù)性，有必要對(duì)接種時(shí)各個(gè)菌液的濃度進(jìn)行測(cè)定，以確定接種時(shí)各個(gè)種子液中活菌的數(shù)目.測(cè)定結(jié)果:乳酸菌3-7為2.0×108個(gè)/mL，乳酸菌 3-9為 1.6×108個(gè)/mL，白地霉菌為9.3×106個(gè)/mL.

2.3 發(fā)酵乳特征指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 黏度測(cè)量結(jié)果

采用流變儀.在4℃下測(cè)試黏度，轉(zhuǎn)子型號(hào)為RV5，分別在16 r/min的速度下測(cè)定3次，每15 s取值一次，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行試樣，結(jié)果計(jì)算算術(shù)平均值.實(shí)驗(yàn)測(cè)得發(fā)酵乳的黏度為8 600 mPa·s.

2.3.2 EPS含量的測(cè)定結(jié)果

按1.4.2和1.4.3方法，對(duì)乳酸菌3-7和3-9與白地霉單菌發(fā)酵所得酸乳以及乳酸菌霉菌聯(lián)合發(fā)酵所得酸乳進(jìn)行EPS含量測(cè)定，結(jié)果見表3.表3顯示，乳酸菌3-9和白地霉發(fā)酵所得酸乳有很高的EPS含量，而乳酸菌與霉菌聯(lián)合發(fā)酵能促進(jìn)酸乳EPS產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，所得發(fā)酵乳EPS含量高達(dá)643.2 mg/L，可賦予發(fā)酵乳更高的有效營養(yǎng)成分.

表3 發(fā)酵乳EPS含量Tab.3 Concentration of EPS

2.4 白地霉揮發(fā)性香氣成分分析

接種量按5%計(jì)，將乳酸菌3-7、乳酸菌3-9、白地霉按體積比50∶5∶45比例混合接種全脂牛乳，采用GC-MS測(cè)定其中風(fēng)味物質(zhì)，其結(jié)果如表4.

表4 白地霉產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析結(jié)果Tab.4 GC-MS results of volatile compounds of Geotrichum candidum

GC-MS共檢測(cè)到29種化合物，與乳酸菌3-7和3-9發(fā)酵所得酸乳相比，白地霉產(chǎn)生了12種新的化合物，其中酸類7種，酯類2種，醇類2種，醛類1種.從面積比來看，含量最高的是己酸正丙酯(47.91%)，其次是辛酸 (15.72%)、癸酸(13.56%)、月桂酸(8.172%)、丁酸(1.672%)，(R)-4-甲基己酸(1.226%).由此可見，白地霉所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為酯類及酸類.可有效提高酸乳中的呈香型物質(zhì)的種類和含量，改善發(fā)酵乳風(fēng)味.

3 結(jié)論

白地霉能發(fā)酵牛乳產(chǎn)生EPS，其質(zhì)量濃度為341.6 mg/L.白地霉與乳酸菌3-7和3-9混合發(fā)酵酸乳，其EPS質(zhì)量濃度可達(dá)643.2 mg/L.由于EPS的存在，該酸乳具有細(xì)膩粘稠的質(zhì)構(gòu)，呈現(xiàn)良好的凝膠穩(wěn)定性，無需依賴食品添加劑賦予其粘稠、穩(wěn)定的酸乳質(zhì)構(gòu).

白地霉與乳酸菌3-7和3-9的最適發(fā)酵溫度均為30℃，是混合發(fā)酵酸乳的基礎(chǔ).在發(fā)酵開始階段，白地霉消耗了發(fā)酵體系內(nèi)的氧氣，為兼性厭氧的乳酸菌3-7和3-9提供了低氧的發(fā)酵環(huán)境.白地霉豐富的蛋白酶和脂肪酶將乳酸菌不能利用的大分子物質(zhì)代謝，為乳酸菌的快速生長提供了良好的營養(yǎng)基礎(chǔ).

對(duì)乳酸菌與白地霉的接種比例進(jìn)行混料試驗(yàn)，確定了乳酸菌3-7、乳酸菌3-9與白地霉的比例為50∶5∶45，在該配比下，所得發(fā)酵乳具有較佳的質(zhì)地及風(fēng)味.

通過GC-MS對(duì)白地霉所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析結(jié)果顯示，白地霉利用牛乳中進(jìn)行脂肪代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為酯類及酸類，可有效地提高牛乳中的呈香型物質(zhì)的種類和含量，改善發(fā)酵乳的風(fēng)味.

本研究通過對(duì)嗜溫乳酸菌3-7和3-9與白地霉的混合發(fā)酵的初步研究，得到EPS含量高、風(fēng)味、口感優(yōu)良的發(fā)酵乳，可為今后功能性酸乳生產(chǎn)提供新的思路，通過進(jìn)一步研究乳酸菌與霉菌間的相互作用，期望更深入了解其發(fā)酵機(jī)理，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的新型功能性酸乳.

［1］劉國榮，李平蘭，王成濤.乳酸菌細(xì)菌素作為天然生物防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，30(2):64-69.

［2］張京，陳存社，張穎，等.產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的選育和鑒定［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，28(5):13-17.

［3］李祥.功能性乳品飲料的市場(chǎng)趨勢(shì)及其機(jī)遇［J］.食品工程，2008(3):26-27.

［4］王偉軍，李延華，張?zhí)m威，等.乳酸乳球菌乳亞種丁二酮變種發(fā)酵乳風(fēng)味成分分析［J］.中國釀造，2009(3):151-153.

［5］李延華，王偉軍，張?zhí)m威，等.發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.中國釀造，2008，14:8-11.

［6］De Vuyst L，Degeest B.Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria［J］.FEMS Microbiol Rev，1999，23:153-187.

［7］Patricia R M，Jeroen H，Pieternela Z.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria［J］.Intenational Dairy Journal，2002(12):1630-1711.

［8］Yang Z N.Antimicrobial compounds and extracellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria:structures and properties［D］.Helsinki:University of Helsinki，2000:26-29.

［9］張英春，馮銳，曹維強(qiáng).乳酸菌胞外多糖的合成及生理功能研究進(jìn)展［J］.中國甜菜糖業(yè)，2008(3):33-36.

［10］Sebastiani H，Zelger G.Texture formation by themophilic lactic acid bacteria［J］.Milchwissenschart，1998，53(1):150-191.

［11］劉奇.高產(chǎn)胞外多糖的嗜酸乳桿菌誘變篩選［J］.中國釀造，2010(6):103-106.

［12］劉亞男，馮娜，薛璨花，等.白地霉的化學(xué)成分研究［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2008，16(1):57-60.

［13］Mdaini N，Gargouri M，Hammami M，et al.Production of natural fruity aroma by Geotrichum candidum［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2006，128:227-236.

［14］王慶國，劉天明，韓小龍，等.兩株產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(6):16-19.

［15］許傳坤，顧雷，周謹(jǐn)，等.白地霉發(fā)酵香料煙種子開發(fā)新型煙用香料研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，59(5):422-425.

［16］Daigle P，Gelinas P，Leblanc D.Production of aroma compounds by Geotrichum candidum on waste bread crumb ［J］.Food Microbiology，1999，16:517-522.

［17］Naziha Mdaini，Mohamed Gargouri，Mohamed Hammami.Production of natural fruity aroma by Geotrichum candidum［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2006，128:227-236.

［18］Marcellino N，Beuvier E，Grappin R，et al.Diversity of Geotrichum candidum strains isolated from traditional cheese making fabrications in France［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67:4752-4759.

［19］Wyder M T.Identification and characterization of the yeast flora in Kefyr and smear ripened cheese.Contribution of selected yeasts to cheese ripening［D］.Zurich:Swiss Federal Institute of Technology，1998.

［20］Corsetti A，Rossi J，Gobbetti M.Interactions between yeasts and bacteria in the smear surface-ripened cheeses［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，69:1-10.

［21］周劍忠，黃開紅，董明盛，等.混料設(shè)計(jì)在藏靈菇奶純培養(yǎng)發(fā)酵劑配方設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(3):816-822.

［22］單成俊，周劍忠，黃開紅，等.黑莓復(fù)合果汁飲料的研制［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6):327-329.

［23］GB 4789.35—2010.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［24］GB 4789.15—2010.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

(責(zé)任編輯:葉紅波)

Study on Yogurt by Mixed Fermentation of Lactococcus Lactis and Geotrichum Candidum

GAO Xin， WANG Chang-lu， CHEN Mian-hua， WANG Yu-rong， LI Feng-juan
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Compared with the high temperature fermented yogurt，mixed fermented yogurt has more volatile compounds and more favorable taste and flavor.In this study，the yogurt was produced by applying two Lactococcus Lactis strains and one Geotrichum candidum strain together.The optimal combination of strains was 50∶5∶45(v/v)，determined by mixture design.The yogurt has high concentration of exopolysaccharides(up to 643.2 mg/L)，which means its high functionality.Besides，the addition of Geotrichum candidum not only increased the EPS concentration in the yogurt，but also increased the types of aroma components and improved the flavor of the yogurt.

Lactococcus lactis;Geotrichum candidum;functional yogurt;exopolysaccharides

TS252.54

A

1671-1513(2012)03-0030-05

2012-01-31

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A06).

高 鑫，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄园l(fā)酵酸乳;

王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.通訊作者.