潘廣彥， 朱傳合， 喬聚林， 鄭振佳

(山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018)

快速高分離液相色譜/四級桿串聯(lián)飛行時間質譜分析山楂籽中的主要黃酮成分

潘廣彥， 朱傳合， 喬聚林， 鄭振佳

(山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018)

采用快速高分離液相色譜/四級桿串聯(lián)飛行時間質譜(RRLC/Q-TOF MS)聯(lián)用技術進行山楂籽中的黃酮類化合物分析方法研究．山楂籽黃酮經超聲輔助提取后，選用Welch Materials C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相組成分別為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫．在正離子模式下，經飛行時間質譜分離并檢測了15種黃酮成分．結果表明，快速分離液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜聯(lián)用技術可以快速準確鑒定樣品中的黃酮成分．

快速高分離液相色譜/四級桿串聯(lián)飛行時間質譜;山楂籽;黃酮

山楂是薔薇科山楂屬植物，是我國傳統(tǒng)中藥與水果．現(xiàn)代藥理研究表明，山楂中黃酮類化合物具有很好的醫(yī)療和保健作用［1］．傳統(tǒng)注重果實、葉方面的研究，但近幾年隨著提取工藝和檢測手段的提高，對山楂籽的研究有了很大進展，尤其是山楂籽中的黃酮，對心血管系統(tǒng)有良好的治療保健作用，是開發(fā)黃酮的優(yōu)質資源［2－4］．目前，山楂及其副產品中黃酮的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、薄層色譜法等［5－9］．但是，以上檢測方法中分析操作檢測時間較長，而且測定的結果容易受到干擾，穩(wěn)定性差，往往不能滿足快速鑒定分析的要求．

飛行時間質譜具有檢測靈敏度高，測定化合物質荷比精確，離子掃描范圍寬等優(yōu)點［10－11］，是一種新興且發(fā)展迅速的質譜技術．為了進一步提高靈敏度或分辨率，飛行時間質譜與氣相色譜、液相色譜、電泳、離子阱及其他質譜聯(lián)用等技術已成為研究的熱點．近年來，快速分離液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜聯(lián)用技術已被廣泛應用于天然產物、中藥復方分析、生命科學等領域［12－15］，逐漸成為植物活性成分定性定量分析的有力的工具，是近幾年來應用最廣的質譜分析技術之一．

本研究采用快速高分離液相色譜/四級桿串聯(lián)飛行時間質譜(rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time offlightmass spectrometer，RRLC/Q-TOF MS)聯(lián)用技術，對山楂籽中的黃酮類化合物進行快速的分析鑒定．該技術操作簡便、快速、準確，而且無需對照品，有利于在生產中對山楂籽黃酮類產品的質量控制，為山楂副產品資源的深度開發(fā)、綜合利用及延長產業(yè)鏈提供技術支持．

1 儀器與試劑

Agilent 1200RRLC/6520型快速高分離液相/四級桿－飛行時間串聯(lián)液質聯(lián)用儀，美國安捷倫公司;乙腈為色譜純，HPLC級甲酸，美國Tedia公司;甲醇為分析純，實驗用水為去離子超純水;山楂籽(山楂產自泰安)，經軟化打漿后沖洗晾干，粉碎至60目待用．

2 實驗

2.1 樣品制備

準確稱取山楂籽粉末1.0 g，于50 mL具塞試管木糖-8-C-葡萄糖芹菜素［vicenin 1(6-C-xylosyl-8-C-glucosyl apigenin)］、大波斯菊苷(7-O-glucoside apigenin)、6-C-hexoside-8-C-pentosideApigenin、6-C-阿拉伯糖-8-C葡萄糖芹菜素(isoschaftoside)、6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖芹菜素(schaftoside)、8-甲氧基山萘酚(8-methoxy kaempferol)．中，加入10 mL甲醇，混勻，室溫下超聲提取15 min，3 500 r/min 離心 15 min，取上清液，過 0.22 μm 濾膜，作為實驗樣品．

2.2 液質聯(lián)用分析條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Welch Materials C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相A為乙腈，流動相B為體積分數(shù)是0.1%甲酸的水溶液;流速1 mL/min;進樣體積20 μL;柱溫30℃;檢測波長260 nm．流動相線性梯度洗脫如表1．

表1 線性梯度洗脫表Tab．1 Procedure of linear gradient elution %

2.2.2 質譜條件

離子源ESI，正離子模式掃描，質量掃描范圍100～1 000m/z，毛細管電壓4 000 V，四極桿溫度100℃，霧化壓力3.45×105Pa(50 psi)，干燥氣流量10 L/min，干燥器溫度350℃，碎裂電壓175 V．

3 結果與討論

3.1 條件優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)在流動相體系中加入適量甲酸可有效抑制酸性化合物的拖尾，更利于增強質譜信號，從而提高靈敏度．實驗考察了甲酸的添加量，結果發(fā)現(xiàn)在水中添加體積分數(shù)0.1%甲酸有效的抑制酸類物質的拖尾現(xiàn)象．質譜檢測分別采用了正、負離子2種掃描模式進行分析，結果發(fā)現(xiàn)正離子模式下峰面積更大、質譜響應更強，比負離子模式更加靈敏，因此本實驗采用正離子模式進行檢測．山楂籽提取液RRLC/Q-TOF MS的總離子流圖見圖1．

圖1 山楂籽提取液的總離子流圖Fig．1 Total ion chromatogram of extracts of hawthorn seed

3.2 山楂籽中黃酮類化合物的分析

本實驗采用RRLC/Q-TOF獲得了山楂籽醇溶性成分的分子離子峰及其精確分子量，見圖2．根據得到山楂籽醇溶性化合物的精確相對分子質量，結合山楂植物化學成分研究報道，參考相關文獻收集了山楂植物中黃酮類化合物共60個［16］，并以此為依據對15種黃酮類化合物進行鑒定．根據圖2由文獻推斷山楂籽黃酮的成分如下．

峰1(圖2f)獲得 m/z 433.146 6［M+H］+質譜信號，峰2(圖2l)獲得m/z 579.150 9［M+H］+質譜信號，峰3(圖2e)獲得m/z 433.146 4［M+H］+質譜信號，峰4(圖2k)獲得m/z 579.149 9［M+H］+質譜信號，峰6(圖2n)獲得 m/z 611.243 0［M+H］+質譜信號，峰7(圖2o)獲得m/z 615.242 9［M+H］+質譜信號，峰8(圖2h)獲得m/z 565.206 0［M+H］+質譜信號，峰9(圖2d)獲得m/z 417.153 6［M+H］+質譜信號，峰10(圖2j)獲得m/z 565.2065［M+H］+質譜信號，峰11(圖2i)獲得m/z 565.2061［M+H］+質譜信號，峰12(圖2g)獲得 m/z 547.360 4［M+H］+質譜信號，峰15(圖2c)獲得m/z 317.208 5［M+H］+質譜信號，根據文獻［17－18］推斷其分別為:異牡荊素(iso-vitexin)、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷(vitexin-2″-O-rhamnoside)、牡荊素(vitexin)、牡荊素-4'-O-鼠李糖苷(vitex-in-4'-O-rhamnoside)、木犀草素類-3'，7-二葡萄糖糖苷(luteolin-3'，7-diglucoside)、2″-O-鼠李糖葒草素(2″-O-rhamnoside-orientin)、6-C-

圖2 山楂籽黃酮的質譜圖Fig．2 Mass spectra of hawthorn seed extracts

峰5(圖2a)獲得m/z 433.146 4［M+H］+質譜信號，峰13(圖2m)獲得 m/z 581.431 7［M+H］+質譜信號，根據文獻［19］推斷其分別為:兒茶精(catechin)、柚皮苷(tectoridin)．

峰14(圖2b)獲得m/z 611.243 0［M+H］+質譜信號，根據文獻［20］推斷其為:異鼠李素(isorhamnetin)．

山楂籽中的黃酮成分液相保留時間、質譜分子離子峰、分子量實驗測定值和理論值如表2，通過比較可以看出分子量實驗測定值和理論值相差很小，說明推導結果的準確可信．

表2 山楂籽提取液中黃酮的RRLC/Q-TOF MS分析Tab．2 RRLC/Q-TOF MS accurate mass measurements of flavones in extract of hawthorn seed

4 結論

本研究采用快速液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜聯(lián)用技術，對山楂籽中的黃酮種類進行快速的分析鑒定，建立了快速分析鑒定山楂籽中15種主要黃酮成分的方法．該方法具有操作簡便準確、無需對照品、試劑消耗少、測定周期短等優(yōu)點，并為山楂植物中黃酮類化合物成分分析提供了一種新的有效、可靠的方法，對植物中有效成分的準確分析鑒定具有重要的意義．

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(責任編輯:李 寧)

Analysis of Flavonoids in Hawthorn Seed using Rapid Resolution Liquid Chromatography-Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer

PAN Guang-yan， ZHU Chuan-he， QIAO Ju-lin， ZHENG Zhen-jia
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

In the paper，a novel method for flavonoids analysis in Hawthorn seed was investigated using rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time of flight mass spectrometer(RRLC/Q-TOF MS)．The flavonoids compounds from Hawthorn seed were extracted by ultrasound-assisted extraction technology and then separated using Welch Materials C18column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)．Water containing 0.1%formic acid and acetonitrile was used as mobile phase．Time-of-flight mass spectrometer(TOF/MS)was applied for qualitative analysis under positive ion mode．Fifteen of the major flavones of hawthorn seed were identified．In conclusion，this method can be used to determine the flavones of Hawthorn seed rapidly．

RRLC/Q-TOF MS;hawthorn seed;flavone

TS207.3

A

1671-1513(2012)06-0052-05

2012-04-25

山東省科技攻關計劃項目(2009GG10009047);泰安市專項計劃項目．

潘廣彥，男，碩士研究生，研究方向為食品科學;

朱傳合，男，副教授，主要從事食品深加工及食品生物技術方面的研究．通訊作者．