β－防御素與牙周健康

石 雪 綜述;丁 一 審校

(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

口腔中存在著數(shù)百種微生物，口腔上皮組織暴露其中，很多人的牙周組織卻仍能保持健康，其原因不僅是口腔上皮所具有的物理屏障作用，口腔環(huán)境內(nèi)的抗菌肽(AMPs)所產(chǎn)生的天然免疫反應(yīng)也起到重要的作用［1－2］。AMPs是一類小分子多肽，分子量3500 ～6500［1］，廣譜抗菌，對 G+、G－細(xì)菌及真菌和病毒等具有抑制作用［3］，其中防御素是其主要成員之一，含有6個(gè)半胱氨酸殘基和3對二硫鍵，根據(jù)半胱氨酸殘基位置和二硫鍵的鏈接方式可分為α－防御素和β－防御素(human beta defensin，HBD)兩類，前者來源于小腸和中性粒細(xì)胞，后者來源于上皮細(xì)胞。兩者的分布、表達(dá)方式及作用均不相同。本文就β－防御素在牙周病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 β－防御素的概況

HBD是人類主要的AMPs之一，具有二硫鍵鏈接的β折疊結(jié)構(gòu)，其基因簇定位于第8條染色體的P22～23區(qū)間，Bensch(1995)首次從腎衰竭病人血透析液中分離出第一類人類β－防御素(HBD－1)至今此家族成員已有6個(gè)。其中可在牙周組織中表達(dá)的為 HBD－1、HBD－2和 HBD－3，后兩者有高度同源性。HBD－1分布于唾液腺導(dǎo)管、胰腺腺泡、陰道等上皮細(xì)胞及牙齦組織、頰舌黏膜中，成組成性表達(dá)，不受炎癥因子水平的影響;HBD－2、HBD－3主要分布于包皮、呼吸道、牙齦組織、頰舌黏膜及皮膚，成誘導(dǎo)性表達(dá)，其表達(dá)可受炎癥因子 IL－1、TNF－α、及細(xì)菌等的調(diào)控;HBD－4 主要在睪丸、胃竇表達(dá);HBD－5僅在睪丸和附睪表達(dá);HBD－6主要在睪丸和附睪表達(dá)，在肺、氣管漿液性細(xì)胞與非杯狀細(xì)胞中也有表達(dá)。

2 β－防御素與牙周健康的關(guān)系

2.1 β－防御素在牙周組織的分布

不同狀態(tài)的牙齦組織中均可有HBDmRNA和蛋白的表達(dá)，在健康牙齦組織，HBD－1與HBD－2的蛋白主要分布于棘層上部、顆粒層以及角化層，HBD－3的蛋白則主要分布于基底細(xì)胞層;在炎癥牙齦組織，HBD－1、HBD－2蛋白的分布與健康時(shí)基本相同，而HBD－3蛋白則不僅分布于基底細(xì)胞層還可在棘層大量檢出［4］。此外，口腔上皮組織中的HBD只能在已表達(dá)外皮蛋白的細(xì)胞中檢出，而外皮蛋白是角蛋白細(xì)胞分化的早期標(biāo)志［5－6］，結(jié)合上皮雖然是牙周炎癥的常見始發(fā)部位，但其中不含有分化的角蛋白細(xì)胞，因此并不能檢測到HBD［7］。說明HBD的表達(dá)與口腔角蛋白細(xì)胞是否分化密切相關(guān)。

2.2 炎癥牙齦組織中β－防御素的表達(dá)

研究表明，在健康牙齦組織中HBD的表達(dá)水平高于炎癥組織，Dunsche等［8］使用RT－PCR 技術(shù)檢測 HBD－1、HBD－2、HBD－3mRNA 在健康牙齦及炎癥牙齦組織中的檢出率，發(fā)現(xiàn)HBDmRNA廣泛分布于健康牙齦組織，三者的檢出率分別為100%、84%、95%;而在炎癥牙齦組織中，三者的檢出率分別為58%、55%、60%，國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果與之相似［9］。此外，不同類型的牙周炎癥，HBD的表達(dá)亦有差別，Vardar－Sengul S 等［10］報(bào)道，在慢性牙周炎組HBD－1的表達(dá)量顯著高于牙齦炎組和侵襲性牙周炎組，而侵襲性牙周炎組中HBD－2的表達(dá)量最高，與其他兩組具有顯著性差異。

牙周炎癥組織中HBD的表達(dá)水平降低以及不同類型牙周炎癥組織中HBD表達(dá)差異的原因目前尚未完全清楚。可能的機(jī)制如下:①牙周炎癥時(shí)產(chǎn)生不同的致炎因子、抗炎因子、酶類的不同作用影響了HBD的表達(dá)，Taggar等［11］研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白水解酶組織蛋白酶B、L、K可下調(diào)HBD－2與HBD－3的表達(dá)，說明在炎癥時(shí)升高的組織蛋白酶可能是降低HBD－2、HBD－3表達(dá)的原因;②不同牙周微生物對HBD的調(diào)控作用可能不同，正常狀態(tài)下的某些共生菌可誘導(dǎo)機(jī)體高表達(dá)HBD，使機(jī)體處于免疫激活狀態(tài)。很多研究表明，常見的幾種牙周致病菌可通過不同的途徑上調(diào)或者下調(diào)HBD的表達(dá)［12－15］。

2.3 幾種主要的牙周可疑致病菌對β－防御素的調(diào)控作用

實(shí)驗(yàn)表明，在體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞(Human Gingival Epithelial Cells，HGECs)和表皮角蛋白細(xì)胞可在炎癥因子IL－1、TNF－α、上皮細(xì)胞激活劑PMA以及多種細(xì)菌的作用下表達(dá)HBD－2、HBD－3［16－17］。其中幾種主要的牙周可疑致病菌可分別通過不同的方式調(diào)控HBD－2及HBD－3的表達(dá)。Kazuhisa Ouhara等［12］對體外培養(yǎng)的 HGECs與伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans)接觸后表達(dá)HBD的研究中發(fā)現(xiàn)，A.actinomycetemcomitans的膜外蛋白100(Omp100)是引起牙齦上皮釋放HBD－2的成分之一，且與其濃度呈正相關(guān)。HBD的釋放不僅通過Omp100－纖連蛋白的相互作用而直接釋放，也通過炎癥引起的細(xì)胞因子刺激而二次釋放。并且不同的 A.actinomycetemcomitans菌株刺激HGECs所產(chǎn)生的防御素種類和濃度也不同，A.actinomycetemcomitans血清型2339可以促進(jìn)HBD－2的強(qiáng)烈表達(dá)，卻不能刺激HBD－3的表達(dá)，而A.actinomycetemcomitans血清型99對HBD－3的誘導(dǎo)作用卻優(yōu)于HBD－2。同樣可上調(diào)HBD－2、HBD－3表達(dá)的牙周可疑致病菌還有具核梭桿菌(Fusobacterium.nucleatum，F(xiàn).nucleatum)，F(xiàn).nucleatum 可通過細(xì)胞壁提取物誘導(dǎo)HBD－2、HBD－3的表達(dá)，但對HBD－1的表達(dá)則沒有誘導(dǎo)作用。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)作為牙周炎的主要致病菌之一，具有高度的蛋白水解性。Chung等［13］研究證明P.gingivalis蛋白水解酶通過蛋白水解酶活化感受器2(PAR－2)和信號(hào)通路，調(diào)節(jié)HGECs對 HBD－2的表達(dá)。P.gingivalis對HBD－3的抗菌能力有一定的抵抗性，P.gingivalis的致病菌株 ATCC49417所產(chǎn)生的蛋白水解酶可下調(diào)HBD－3的釋放且降低其抗菌能力。P.gingivalis上清液對HBD－3的下調(diào)作用存在濃度－時(shí)間依賴關(guān)系。這種下調(diào)作用是由于激活的 P.gingivalis蛋白水解酶 RgpB(Arg－gingipain)和 Kgp(lys－gingipain)引起的，而使用對這兩種蛋白水解酶的選擇性抑制劑預(yù)處理P.gingivalis培養(yǎng)上清液可抑制其下調(diào)HBD－3的表達(dá)，并增加其對 HBD－3 的敏感性［14］，說明P.gingivalis的產(chǎn)物水解蛋白酶可能是使P.gingivalis ATCC49417對HBD－3不敏感的原因之一。

Shin等［15］研究發(fā)現(xiàn)，齒垢密螺旋體(Treponema denticola，T.denticola)可抑制人牙齦上皮細(xì)胞對HBD的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有活力的T.denticola可以明顯抑制人牙齦上皮細(xì)胞對HBD－3的釋放，并且同時(shí)可以抑制HBD－1，HBD－2的表達(dá)。相反，熱失活的細(xì)菌卻可穩(wěn)定的輕微上調(diào)HBD－2和HBD－3的釋放。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，T.denticola含有一個(gè)Toll樣受體2(TLR2)的熱依賴抑制劑，T.denticola可通過Pam3CSK途徑阻止TLR2被激活，而TLR2軸鏈正是抑制人牙齦上皮細(xì)胞對HBD－3表達(dá)的原因。這可為T.denticola引起的牙周炎的研究提供一個(gè)新的思路。

另有研究報(bào)道，口腔細(xì)菌對HBD－2、HBD－3表達(dá)的調(diào)控，并不是通過核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF－κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而是通過JNK、促細(xì)胞分裂原p38所激活的有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路［17－18］及細(xì)胞外鈣離子通道［21］。

2.4 β－防御素對口腔菌群的抗菌效果

口腔菌群種類繁多，細(xì)菌密度高、數(shù)量大，主要成員有需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌。口腔上皮與多種細(xì)菌密切接觸，其表達(dá)的HBD在抗牙周致病菌入侵的天然免疫和獲得性免疫中均有重要作用，然而具有廣譜抗菌作用的HBD對口腔內(nèi)不同菌群的抗菌效果也因細(xì)菌對HBD的敏感性不同而有明顯的差異。體外研究表明，需氧菌，如血鏈球菌(Streptococcus sanguis)、變異鏈球菌(Steptococcus mutans)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)、衣氏放線菌(Actinomyces israelee)、大腸桿菌(Escherichia coli)較厭氧菌 A.actinomycetemcomitans、P.gingivalis、F.nucleatum、微小消化鏈球菌(Peptostreptococcus micros)對 HBD－2、HBD－3更為敏感［19］。因此，少量 HBD－2、HBD－3 便可對需氧菌有抑制作用，可助于機(jī)體對早期定植菌增殖的控制。對厭氧菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則各不相同，F(xiàn).nucleatum是對HBD最敏感的細(xì)菌，P.gingivalis則對HBD有很高的耐受性。與厭氧菌菌種差異性同樣明顯的還有菌株差異性，例如，F(xiàn).nucleatum的不同菌株對于HBD的敏感性不同，F(xiàn).nucleatum血清型21對HBD－3的敏感性非常高，HBD－3濃度為1 mg/L時(shí)便可將其完全殺滅，當(dāng) HBD－2或HBD－3濃度為共生需氧菌的抑菌濃度250 μg/mL時(shí)，對部分菌株無抑制作用，而對部分菌株有效［20］。有學(xué)者認(rèn)為HBD對不同菌種以及菌株的抗藥效果的差異，可能與細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的化學(xué)成分不同，或者其包膜化學(xué)成分不同［19］有關(guān)。密螺旋體缺乏傳統(tǒng)的 LPS，對HBD有天然的抵抗力，說明同一菌種的不同菌株間LPS及脂低聚糖多樣性可能是不同菌株對HBD敏感性不同的原因［22，24］。此外，HBD－3 較家族其他成員的抗菌譜更寬，且對牙周可疑致病菌A.actinomycetemcomitans、P.gingivalis、中間普氏菌(Prevotella intermedia，P.ntermedia)、F.nucleatum 的抗菌活性更強(qiáng)［19］，這可能是由于二者作用靶點(diǎn)不同所致，HBD－2的優(yōu)先作用靶目標(biāo)為LPS，而HBD－3可以作用于不同的靶點(diǎn)。

2.5 β－防御素的其他功能

最近一項(xiàng)研究顯示，HBD－3除具有多種抗菌活性且外還具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用。Wang等［23］在體外對3組牙周炎離體牙組和3組健康對照組分別給予不同的處理，觀察牙根表面成纖維細(xì)胞的附著和增殖情況。第一組牙周炎離體牙組和健康對照組行齦下刮治及根面平整術(shù)(scaling and root planning，SRP)、第二組牙周炎離體牙組和健康對照組行SRP并予100 ng/mL HBD－3涂予牙根表明、第三組牙周炎離體牙組和健康對照組行SRP并予200 ng/mL HBD－3涂于牙根表明。治療后均接種牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3組牙周炎患牙組中，200 ng/mL HBD－3組的牙根表面成纖維細(xì)胞的附著和增殖水平明顯高于另兩組，并且后兩組的成纖維細(xì)胞數(shù)要明顯的多于僅使用SRP組。在健康對照組中，使用HBD－3的兩組，7 d時(shí)成纖維細(xì)胞生長良好且形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。說明，HBD－3在抗菌及促進(jìn)成纖維細(xì)胞增長方面均有重要作用，因此可促進(jìn)牙周組織的再生。同時(shí)，HBD－3在感染性疾病中可能具有再生促進(jìn)作用。

3 展望

防御素在維護(hù)口腔健康的過程中起到重要作用，研究表明HBD與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切，但目前研究尚處于初級(jí)階段，且多為體外研究，目前仍需進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的調(diào)控途徑及與口內(nèi)細(xì)菌的相互作用機(jī)制、有無毒性或其他不良反應(yīng)。HBD擁有廣譜高效的抗菌活性，能夠快速殺滅廣譜抗原微生物，且其作為人體自身活性物質(zhì)，對其具有抵抗性的細(xì)菌較少，細(xì)菌不易對其產(chǎn)生耐藥性，在口腔局部用藥及全身廣譜抗菌治療方面具有廣闊的前景，希望能成為牙周疾病以及其他口腔疾病檢查、診斷、治療的有效工具。

［1］Dale BA.Periodontal epithelium:a newly recognized role in health and disease［J］.Periodontol，2000，2002，30:70 －78.

［2］Gznz T.Defensins:antimicrobial peptides of vertebrates［J］.C R Biol，2004，327(6):539 －549.

［3］Premratanachai P，Joly S，Johnson GK，et al.Expression and regulation of novel human beta defensins in gingival keratinocytes［J］.Oral Microbiol Immunol，2004，19(2):111 －117.

［4］Lu Q，Samaranayake LP，Darveau RP，et al.Expression of human beta－defensin－3 in gingival epithelia［J］.J Periodontal Res，2005，40(6):474 －481.

［5］Dale BA，Kimball JR，Krisanaprakornkit S，et al.Localized antimicrobial peptide expression in human gingival［J］.J Periodontal Res，2001，36(5):285 －294.

［6］Dale BA，Krisanaprakornkit S.Defensin antimicrobial peptides in the oral cavity［J］.J Oral Pathol Med，2001，30(6):321 －327.

［7］Dale BA，F(xiàn)redericks LP.Antimicrobial peptides in the oral environment:expression and function in health and disease［J］.Curr Issues Mol Biol，2005，7(2):119 －133.

［8］Dunsche A，Acil Y，Dommisch H，et al.The novel human beta－defensin－3 is widely expressed in oral tissues［J］.Eur J Oral Sci，2002，110(2):121 －124.

［9］張旭，束蓉.β－防御素基因在牙齦組織中的表達(dá)［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2006，22(1):34 －37.

［10］Varear－Sengul S，Demirci T，Sen BH，et al.Human beta defensin－1 and－2 expression in gingiva of patients with specific periodontal diseases［J］.J Periodontal Res，2007，42(5):429 －437.

［11］Taggart CC，Greene CM，Smith SG，et al.Inactivation of human beta－defensins 2 and 3 by elastolytic cathepsins［J］.J Immunol，2003，171(7):931 －937.

［12］Ouhara K，Komatsuzawa H，Shiba H，et al.Actinobacillus actinomycetemcomitans outer membrane protein 100 triggers innate immunity and production of beta－defensin and the 18－kilodalton cationic antimicrobial protein through the fibronectin－integrin pathway in human gingival epithelial cells［J］.Infect Immun，2006，74(9):5211－5220.

［13］Chung WO，Hansen SR，Rao D，et al.Protease－activated receptor signaling increases epithelial antimicrobial peptide expression［J］.J Immunol，2004，15;173(8):5165 － 5170.

［14］Maisetta G，Brancatisano FL，Esin S，et al.Gingipains produced by porphyromonas gingivalis ATCC49417 degrade humanβ－defensin 3 and affect peptide’s antibacterial activity in vitro［J］.Pept ides，2011，32(5):1073 －1077.

［15］Shin JE，Kim YS，Oh JE，et al.Treponema denticola suppresses expression of human beta－defensin－3 in gingival epithelial cellsthrough inhibition of the toll－li ke receptor 2 axis［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，78(2):672 －679.

［16］Harder J，Meyer－h(huán)offert U，Teran LM，et al.Mucoid Pseudomonas aeruginosa，TNF－alpha，and IL－1beta，but not IL－6，induce human beta－defensin－2 in respiratory epithelia［J］.Am J Respir Cel Mol Biol，2000，22(4):714 －721.

［17］Chung WO，Dale BA.Innate immune response of oral and foreskin kerationcytes:utilization of different signaling pathways by various bacterial species［J］.Infect Immun，2004，72(1):352－358.

［18］Krisanaprakornkit S，Kimball JR，Dale BA.Regulation of human beta－defensin－2 in gingival epithelial cells:the involvement of mitogen－activated protein kinase pathways，but not the NF－kappaB transcription factor family［J］.J Immunol，2002，168(1):316－324.

［19］Ouhara K，Komatsuzawa H，Yamada S，et al.Susceptibilities of periodontopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides，beta－defensins and LL37，produced by human epithelial cells［J］.J Antimicrob Chemother，2005，55(6):888 －896.

［20］Joly S，Maze C，McCray PB Jr，et al.Human beta－defensins 2 and 3 demonstrate strain selective activity against oral microorganisms［J］.J Clin Microbiol，2004，42(3):1024 － 1029.

［21］Krisanaprakornkit S，Jotikasthira D，Dale BA.Intracellular calcium in signaling human beta－defensin－2 expression in oral epithelial cells［J］.J Dent Res，2003，82(11):877 －882.

［22］Brissette CA，Lukehart SA.Treponema denticola is resistant to human beta－defensins［J］.Infec Immun，2002，70:3982 －3984.

［23］Wang H，Watanabe H，Ogita M，et al.Effect of human betadefensin－3 on the proliferation of fibroblasts on periodontally involved root surfaces［J］.Peptides，2011，32(5):888 － 894.Epub 2011 Feb 12.

［24］Brissette CA，Lukehart SA.Mechanisms of decreased susceptibility to beta－defensins by Treponema denticola［J］.Infect Immun，2007，75(5):2307－2315.