林 鋒，姚江武，2

(1.市口腔醫(yī)院修復(fù)科，福建廈門 361003;2.福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科，福建福州 350002)

在日常生活中，茶、紅酒和食用色素是天然牙最經(jīng)常接觸到的著色物。茶黃素(theaflavin，TF)、姜黃素(curcumin，Cur)和矢車菊素(cyanidin，Cy)等是分別來自于茶葉、姜黃和葡萄的提取物，廣泛應(yīng)用于食品添加劑中［1］。天然色素作為色源體與人唾液(human whole saliva，WS)作用，一方面沉積于牙面或義齒表面形成色漬，影響美觀，另一方面色素與唾液蛋白結(jié)合，不但會(huì)抑制蛋白質(zhì)的活性，同時(shí)色素－蛋白質(zhì)復(fù)合物還會(huì)覆蓋于口腔黏膜表面，使之產(chǎn)生干燥和皺縮感［2］。要了解色素沉著于牙齒表面和口腔黏膜的原因，就必須破解色素與唾液生物膜之間的作用機(jī)制。而且只有通過在體外構(gòu)建牙著色的生理和生物學(xué)過程實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停拍芨玫貫檠芯款A(yù)防和清除牙著色方法提供理論依據(jù)，因此，必須首先考察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)口腔色素生物膜形成的影響。

表面等離子體共振(surface plasma resonance，SPR)技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子自組裝于SPR傳感器芯片表面，具有生物樣品無需標(biāo)記、原位、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程的特點(diǎn)，特別適合于研究聚合物高分子與蛋白質(zhì)相互之間的作用機(jī)制，因此成為近年來生物學(xué)和材料學(xué)探索的新工具。本研究采用TF、Cur和Cy作為聚合物高分子色源體，利用SPR技術(shù)和表面吸附動(dòng)力學(xué)原理，將WS自組裝于芯片表面，考察不同溫度、pH值和離子強(qiáng)度的條件下，對(duì)色素吸附于WS表面形成色素生物膜的影響，以期在未來對(duì)牙著色的研究中，能夠建立更加符合牙著色的生理和生物學(xué)過程的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

表面等離子共振儀(Reichert SR7000DC，美國);低溫離心機(jī)(Biofuge Fresco，Heraeus，德國);超純水器(Millipore Direct－Q3，Millipore，法國)。純度≥98% 的TF、Cur和Cy(Woko純化學(xué)工業(yè)，日本);二甲基亞砜(DMSO，上海西寶生物);11－巰基十一烷酸(11－MUA);1、3－二甲基氨基丙基－3－乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC);N－羥基琥珀酰亞胺(NHS);牛血清白蛋白BSA和流動(dòng)緩沖液 PBST(Sigma，美國)。

1.2 WS的收集及其蛋白質(zhì)濃度測定

1.2.1 WS 的收集

選擇10名口腔狀況良好，無吸煙習(xí)慣的成人自愿者為對(duì)象，均在同一環(huán)境、上午8:00～10:00、空腹、禁止刷牙的情況下，經(jīng)咀嚼棉球來收集刺激性全唾液，以避免環(huán)境及晝夜生理節(jié)律對(duì)唾液成分的影響。自愿者取坐位、低頭、微張口，棄去第一口唾液后，讓唾液自然流入置于冰上的離心管中?？偣彩占僖?000 mL，4℃下，12000 r/min。離心10 min，取上清液存于－80℃冰箱中備用。步驟詳見文獻(xiàn)［3］。

1.2.2 WS 蛋白質(zhì)濃度測定

采用Bradford法測定WS蛋白質(zhì)濃度。首先繪制BSA液濃度與吸光度值(A595)的關(guān)系圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，取唾液樣本0.04 mL，加超純水至0.1 mL，再加入考馬斯亮藍(lán)G－250試劑5 mL，混合5 min后測光吸收值A(chǔ)595。對(duì)照BSA液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得WS的蛋白質(zhì)濃度。步驟詳見文獻(xiàn)［4］。

1.3 自組裝WS膜

芯片浸泡于60℃的10 mmol/L 11－巰基十一烷酸(11－MUA)/純乙醇中24 h，取出后用純乙醇沖洗，氮?dú)獯蹈?。通入的體積比為 1∶1的0.2 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS 混合液1 mL，活化SPR芯片10 min。注入1 mL的WS液至吸附達(dá)到穩(wěn)態(tài)，再注入1 mol/L pH 8.5的乙醇胺鹽酸1 mL，維持10 min，形成WS自組裝單分子膜(self－assembled monolayer，SAM)。

1.4 SPR 動(dòng)態(tài)監(jiān)測

在不同的 pH 值(6、6.8、7.4，25 ℃，10 mmol/L PBST)、溫度(25、30、35 ℃，10 mmol/L PBST，pH 值6.8)和離子強(qiáng)度(2.5、5、10、12.5、25、50 mmol/L PBST，25℃，pH 值6.8)條件下，形成不同的系統(tǒng)緩沖體系。以5 μL/min的流速分別將45 μmol/L的3種色素通入測量池，與固定于芯片上的全唾液相互作用，直至色素的吸附達(dá)到穩(wěn)態(tài)，實(shí)時(shí)記錄SPR芯片上發(fā)生反應(yīng)的傳感圖譜。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用 SPSS 13.0 軟件(SPSS Institute Inc，美國)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 WS蛋白質(zhì)的濃度

所采集的唾液經(jīng)用Bradford法測定，其蛋白質(zhì)濃度平均為1.043 mg/mL。

2.2 溫度和pH值的作用

由響應(yīng)強(qiáng)度(response unit，RU)計(jì)算得到的WS表面色素的吸附量與溫度(圖1a)和pH值(圖1b)的函數(shù)關(guān)系圖。3種色素在WS表面的響應(yīng)強(qiáng)度均隨著溫度和pH值的升高而逐漸減少，表明吸附量亦隨之逐漸減少。不同pH、不同溫度組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 離子強(qiáng)度的作用

色素吸附量與離子強(qiáng)度的函數(shù)關(guān)系(圖1c)可見，離子強(qiáng)度對(duì)WS/色素之間相互作用的影響較為復(fù)雜。當(dāng)離子強(qiáng)度低于5 mmol/L時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的增大，3種色素在WS表面的吸附量均減小，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。當(dāng)離子強(qiáng)度由5.0 mmol/L提高到12.5 mmol/L時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的增大，3種色素在WS表面的吸附量也增大，呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05);當(dāng)離子強(qiáng)度超過12.5 mmol/L時(shí)，3種色素在WS表面的吸附量隨著離子強(qiáng)度的增大反而出現(xiàn)負(fù)增長(P＜0.05)。

圖1 不同溫度、pH值和離子強(qiáng)度與WS表面色素吸附量的關(guān)系(*P＜0.05)

3 討論

SAM是分子通過化學(xué)鍵相互作用自發(fā)吸附在固/液或氣/液界面，形成熱力學(xué)穩(wěn)定、能量最低的有序膜。在本研究中，11－MUA末端的羧基在以EDC為催化劑的條件下與NHS反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為N－羥基琥珀酰亞胺酯，從而與唾液蛋白質(zhì)分子中的氨基反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合，將蛋白質(zhì)固定在固體表面。

在熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng)體系中，疏水性相互作用常常隨著溫度的增高而加大［5－6］。當(dāng)反應(yīng)溫度升高時(shí)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生了構(gòu)象改變，由折疊狀態(tài)向伸展?fàn)顟B(tài)變化，從而暴露出較多的與聚合物發(fā)生疏水性反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，使得蛋白質(zhì)/聚合物之間的疏水性反應(yīng)增強(qiáng)，故蛋白質(zhì)與聚合物之間的結(jié)合增加。反之，當(dāng)反應(yīng)溫度降低時(shí)，蛋白質(zhì)分子的折疊狀態(tài)更緊密，使蛋白質(zhì)表面的疏水性結(jié)合位點(diǎn)減少，與聚合物之間的反應(yīng)強(qiáng)度減弱，最終導(dǎo)致吸附量減少。在本研究中，當(dāng)溫度升高時(shí)，3種色素在唾液表面的吸附量降低。提示反應(yīng)體系中疏水性反應(yīng)不是唾液與色素相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力。該結(jié)果與Chitpan等的牛血清白蛋白與茶紅素相互作用的研究結(jié)論一致［7］。

唾液是由多種蛋白質(zhì)組成的兩性分子混合物［8］，已知蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectric point，pI):黏液素5B(pI 6.2)、溶菌酶(pI 11.0)、乳鐵蛋白(pI 8.6)、乳過氧化物酶(pI 8.3)、組蛋白 5(pI 10.3)、α － 淀粉酶(pI 6.3)［9］。本研究中，當(dāng)溶液的pH=6.0時(shí)，唾液蛋白質(zhì)表面帶正電荷，色素分子帶負(fù)電荷，二者之間具有較強(qiáng)的靜電吸引作用，從而形成最大的吸附質(zhì)量。當(dāng)溶液的pH=7.4時(shí)，WS與色素分子均帶負(fù)電荷，二者之間形成靜電排斥作用而導(dǎo)致吸附量的大幅降低。當(dāng)溶液的pH=6.8時(shí)，色素吸附于唾液蛋白質(zhì)表面的質(zhì)量介于pH 7.4和pH 6.0之間。隨著pH值的升高，3種色素在唾液表面的吸附量逐漸減少趨勢(shì)。因此，唾液蛋白質(zhì)與色素分子表面電荷之間的靜電反應(yīng)在蛋白質(zhì)–色素的相互作用中具有重要作用。

在本研究中離子強(qiáng)度對(duì)唾液–色素之間相互作用的影響較為復(fù)雜。相似的離子強(qiáng)度(I)效應(yīng)在唾液與茶多酚高分子的相互作用，在我們從前的研究中也有發(fā)現(xiàn)［5－6］，這些錯(cuò)綜復(fù)雜的離子強(qiáng)度效應(yīng)是由于唾液蛋白質(zhì)分子復(fù)雜的帶電特性所造成的。唾液蛋白質(zhì)既帶有正電荷，也帶有負(fù)電荷，與色素分子之間同時(shí)存在靜電吸引和靜電排斥作用。而靜電吸引和靜電排斥作用與唾液蛋白質(zhì)正電荷位點(diǎn)和色素負(fù)電荷位點(diǎn)(R+)及唾液蛋白質(zhì)負(fù)電荷位點(diǎn)和色素之間負(fù)電荷位點(diǎn)(R–)的平均距離，以及德拜距離Rd(Rd≈0.3/I1/2)有關(guān)［5－6］。當(dāng)色素吸附于唾液蛋白質(zhì)表面在離子強(qiáng)度從5至12.5 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，則有R+＜Rd＜R–，離子強(qiáng)度增加的主要作用是屏蔽靜電排斥作用，但不會(huì)影響色素與唾液蛋白質(zhì)之間的靜電吸引作用，最終導(dǎo)致了色素與唾液蛋白質(zhì)之間的作用增強(qiáng)，色素吸附量增加。反之，當(dāng)離子強(qiáng)度高于12.5，則有Rd＜ R+＜R–，增加的離子強(qiáng)度同時(shí)屏蔽靜電吸引與排斥作用，因此出現(xiàn)色素與唾液相互作用減弱，吸附量逐漸減少。然而當(dāng)離子強(qiáng)度低于5.0 mmol/L時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的減小促進(jìn)了蛋白質(zhì)–色素間形成復(fù)合物，導(dǎo)致相應(yīng)吸附量隨離子強(qiáng)度的降低而增大。

本研究在不同的pH值、溫度和離子強(qiáng)度的條件下，通過表面等離子體共振技術(shù)，考察了3種色素吸附于人唾液蛋白質(zhì)表面的動(dòng)力學(xué)特性。研究表明:伴隨著pH值和溫度的升高，3種色素與唾液的相互作用強(qiáng)度減弱，色素在唾液表面的吸附量降低。離子強(qiáng)度對(duì)于色素吸附于唾液表面的作用頗為復(fù)雜，與唾液蛋白質(zhì)分子復(fù)雜的兩性帶電特性有密切關(guān)系，可能與色素和唾液蛋白質(zhì)分子之間的屏蔽靜電吸引與排斥作用有關(guān)。由此可見，唾液蛋白質(zhì)與色素之間的作用驅(qū)動(dòng)力源自靜電反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)為構(gòu)建具有良好穩(wěn)定性的體外色素著色模型提供了實(shí)驗(yàn)參數(shù)依據(jù)，將有助于進(jìn)一步探索清除和預(yù)防牙表面形成色漬的機(jī)制，為預(yù)防牙著色的形成和了解口腔黏膜表面產(chǎn)生干燥和皺縮感的生理學(xué)機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。今后尚需利用光譜學(xué)進(jìn)一步考察色素對(duì)唾液蛋白質(zhì)構(gòu)象和生化特性的影響。

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