李建忠 張志培 汪健 吳凡 金巖 韓勇 姜濤 閆小龍 倪云峰 趙晉波 李小飛

組織工程同種異體氣管移植是當(dāng)前氣管外科領(lǐng)域研究的重點。已有報道用酶洗法制備豬氣管支架，但實驗尚存在諸多不確定因素[1]，國內(nèi)外尚未有用酶洗法制備兔氣管支架研究的相關(guān)報道。本實驗探討酶洗法制備兔氣管支架的適宜周期，為研究組織工程同種異體氣管移植提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），脫氧核糖核酸酶-Ⅰ（DNase-Ⅰ）（Roche公司，德國），兩性霉素 B(Amresco公司，美國)，青霉素（哈藥集團制藥總廠），蔡司正置顯微鏡Axioskop 40（ZEISS公司，德國），鎢燈絲掃描電鏡VEGA3 LMH（Tescan公司，捷克），電子實驗機（Shimadzu公司，日本）。

1.2 實驗動物與分組

健康新西蘭兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0 Kg，雌雄不限，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。隨機等分為4 組（n=6）。A 組，對照組，新鮮氣管；B、C、D 組，實驗組，氣管分別經(jīng)過2、3、4個周期的處理。

1.3 氣管支架制備方法

耳緣靜脈空氣栓塞致死，無菌條件下取出氣管，迅速剝離氣管上的疏松結(jié)締組織。經(jīng)含有1%青霉素、1%兩性霉素B的PBS緩沖液沖洗3～4min后，A組氣管浸泡在4℃的PBS緩沖液中準(zhǔn)備檢測；B、C、D組氣管沖洗后均置入4℃純凈水中浸泡48 h。取出后在含有4%脫氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3 h，PBS沖洗3～4min。然后在含有2000 KU/LDNase-Ⅰ的生理鹽水中浸泡3 h，B、C、D組分別如此循環(huán)2、3、4個周期，處理好的標(biāo)本浸泡在4℃的PBS溶液中準(zhǔn)備檢測。

1.4 檢測方法

將處理后的氣管參照 Macchiarini［2］生物力學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)進行完整氣管力學(xué)檢測；取長約0.5 cm氣管環(huán)于中性福爾馬林固定24h，行脫水、浸蠟、包埋、切片處理后，HE染色后組織學(xué)觀察；取長約1.5 cm氣管環(huán)以戊二醛固定后，掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生物力學(xué)檢測

生物力學(xué)檢測顯示：各組氣管長度均數(shù)不相等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組間兩兩比較顯示，D組最大拉伸力、破裂力、變異率均小于A組、B組、C組，差異顯著（P＜0.05）；而 A 組、B 組、C 組兩兩比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（表1）

表1 氣管支架生物力學(xué)比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups（）

表1 氣管支架生物力學(xué)比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups（）

變異率（%）對照組 A 5.02±0.604.465±0.65 0.645±0.072 9.64±0.48 202±8實驗組 B 4.98±0.574.425±0.55 0.535±0.082 9.48±0.50 198±10實驗組 C 4.96±0.584.375±0.45 0.525±0.064 9.58±0.52 197±9實驗組 D 5.10±0.612.855±0.30*0.350±0.042*9.86±0.46142±18*組 別 氣管長度（cm）最大拉伸力（N） 破裂力(N) 破裂點（cm）

2.2 組織學(xué)觀察

HE染色顯示：A組氣管黏膜上皮組織可見大量完整的黏膜上皮細胞；B組氣管黏膜上皮組織見部分完整黏膜上皮細胞；C組、D組氣管黏膜上皮細胞未見完整的黏膜上皮細胞（圖1）。

圖1 組織學(xué)觀察（HE，400×）Fig.1 Histological observation of tracheas(HE,400×)

2.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡顯示A、B、C組的氣管支架膠原纖維間有殘存的細胞基質(zhì)，膠原纖維較粗；D組的氣管支架未見細胞基質(zhì)，膠原纖維較細（圖2）。

圖2 掃描電鏡觀察：（SEM，3000×）Fig.2 Ultrastructure observation by SEM(SEM,3000×)

3 討論

全球首例組織工程同種異體左主支氣管成功移植［3］后，組織工程同種異體氣管移植已成為氣管重建領(lǐng)域的研究熱點，但尚未有組織工程同種異體氣管移植的相關(guān)報道。氣管支架的構(gòu)建和再細胞化是構(gòu)建組織工程同種異體氣管的主要制約因素。氣管支架既需有理想的去抗原效果、生物力學(xué)性能，又需最大限度地保持細胞外基質(zhì)的完整性，以達到支架支撐效果，并有助于同種異體成軟管細胞和氣管黏膜上皮細胞的再細胞化。

在深低溫冷凍法［4-5］、玻璃化液冷凍法［6-7］及酶洗法［1-3］三種主要制備氣管支架的方法中，酶洗法越來越受到關(guān)注。本研究采用酶洗法分別處理3個實驗組2、3、4個周期，制備氣管支架，并與未處理氣管進行比較。生物力學(xué)結(jié)果比較顯示，處理3個周期的氣管支架的最大拉伸力、破裂力和變異率顯著大于處理4個周期的氣管支架。實驗證明處理周期太短則有完整的黏膜上皮細胞殘存，不能有效去除氣管的抗原性，處理周期太長則損壞細胞外基質(zhì)，影響氣管支架的再細胞化。綜上所述，采用4%脫氧膽酸鈉及2000 KU/L DNase-Ⅰ處理兔氣管3個周期，既具有理想的去抗原效果、生物學(xué)性能，又最大限度地保持了細胞外基質(zhì)的完整性，適于構(gòu)建兔組織工程同種異體氣管。

[1]Go T,Jungebluth P,Baiguero S,et a1.Both epithelial cells and mesenchymal stem cell derivedchondrocytes contribute to the survival of tissue-engineered airwaytransplants in pigs[J].Thorac Cardiovasc Surg,2010,139(2):437-443.

[2]Macchiarini P,Baiguera S,Jungebluth P,et a1.Tissue engineered human tracheas for in vivo implantation[J].Biomaterials,2010,31(34):8931-8938.

[3]Macchiarini P,Jungebluth P,Go T,et al.Clinicaltransplantation of a tissue-engineered airway[J].Lancet,2008,372(9655):2023-2030.

[4]閆小龍,李小飛,劉勇.深低溫冷凍對rhBMP-2誘導(dǎo)犬氣管移植體軟骨再生的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,26(2):160-163.

[5]Autissier A,Le Visage CL,Pouzet C,et a1.Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process[J].Acta Biomater,2010,6(9):3640-3648.

[6]史宏燦,徐洪,吳俊,等.玻璃化冷凍同種異體氣管移植動物模型的建立[J].中華外科雜志,2008,46(20):1589-1590.

[7]Xu H,Shi HC,Zhang WF,et a1.An experimental research on cryopreserving rabbit trachea by vitrification[J].Cryobiology,2009,58(2):225-231.