角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2基因siRNA的篩選

袁磊 金蓉 張艷 張余光

蛋白酶激活受體-2（PAR-2）是一種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體分子。在人體表皮中，角質(zhì)形成細(xì)胞膜上存在著PAR-2，而在黑素細(xì)胞中不表達(dá)。Seiberg等[1]發(fā)現(xiàn)，在黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞三維雙相共培養(yǎng)體系中，存在于角質(zhì)形成細(xì)胞中的PAR-2激活后參與黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)，能促進(jìn)皮膚色素沉著。使用大豆胰蛋白酶抑制劑抑制PAR-2的激活，可完全抑制紫外線(xiàn)（UVR）引起的皮膚“曬黑”效應(yīng)。目前，PAR-2被認(rèn)為在黑素小體傳輸過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

但是，以往針對(duì)PAR-2在黑素小體傳輸過(guò)程中作用的研究，均未針對(duì)其基因水平特異性的報(bào)道。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，是指細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性雙鏈 RNA（Double stranded RNA，dsRNA）或?qū)胪庠葱詃sRNA后，與dsRNA同源的內(nèi)源性mRNA發(fā)生特異性的降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。因這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-transcriptional genesilencing，PTGS）[2-3]。RNA干擾作用與靶基因的抑制劑作用相比，具有高度的特異性，從而更能闡明PAR-2在傳輸過(guò)程中的作用和色素傳輸?shù)臋C(jī)制。

我們使用軟件針對(duì)PAR-2基因設(shè)計(jì)siRNA序列，利用化學(xué)合成法合成siRNA片段，并轉(zhuǎn)入角質(zhì)形成細(xì)胞后，通過(guò)半定量RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)其對(duì)PAR-2 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，以期找到可靠的抑制PAR-2基因表達(dá)的siRNA片段，為進(jìn)一步研究PAR-2的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人PAR-2多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)）；羊抗兔二抗（Dako公司，丹麥）；轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美國(guó)）；角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加物和dK-SFM培養(yǎng)基（Cascade Biologics公司，美國(guó)）；Trizol RNA 抽提試劑盒（Gibco公司，美國(guó)）；RT-PCR試劑盒（Takara公司，日本）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

角質(zhì)形成細(xì)胞取自臨床小兒包皮環(huán)切手術(shù)后的廢棄包皮組織。培養(yǎng)基為添加角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加物的dK-SFM，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代，取純化后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.3 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

首先根據(jù)基因庫(kù)中報(bào)道的人類(lèi)PAR-2基因序列（GI:55065），并采用Ambion公司的網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)人PAR-2基因不同位點(diǎn)的siRNA靶序列，另設(shè)計(jì)1對(duì)陰性對(duì)照siRNA序列。4段序列經(jīng)BLAST檢索證實(shí)與其他基因無(wú)同源性，送上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成，合成的陰性對(duì)照siRNA帶有FAM標(biāo)記（表1）。

表1 PAR-2mRNA的siRNA序列Table 1 siRNA sequence of targeted PAR-2 mRNA

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前一天，以5×104cells/mL的密度，將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入約500μL無(wú)抗生素的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，并使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞到達(dá)70%融合。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，每組8孔，分別為空白對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA）、實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染特異性的siRNA）。先轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA，分別以20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L和100 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，以摸索最佳轉(zhuǎn)染條件。按照轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine 2000使用說(shuō)明，將化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)入角質(zhì)形成細(xì)胞，6 h后即可在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.5 半定量RT-PCR檢測(cè)PAR-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

于轉(zhuǎn)染后48 h，收集6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，按照Trizol RNA抽提試劑盒說(shuō)明，提取RNA。采用RTPCR試劑盒，檢測(cè)PAR-2 mRNA的表達(dá)量。應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)合適的PAR-2引物，再由上海生工生物工程有限公司合成。PAR-2引物序列為：上游引物5'-CCGAACTAAGAAGAAGCACC-3'，下游引物5'-AGAAAAAGCCAATAAGCACACAT-3'。內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PAR-2擴(kuò)增產(chǎn)物為 355 bp，GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物為 452 bp。PCR產(chǎn)物 20μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠、80 V電壓電泳1 h（100 bp的DNA marker作為外參照），用天能凝膠分析系統(tǒng)拍照觀察，并對(duì)PAR-2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，以PAR-2與GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的灰度掃描比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測(cè)PAR-2的表達(dá)

于轉(zhuǎn)染后48 h裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，福林-酚法蛋白定量。以各組總蛋白為模板，GAPDH為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗，二抗雜交孵育，最后顯色劑顯色，成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)。以GAPDH（67 KDa）作為內(nèi)參照，檢測(cè)各組PAR-2蛋白（44 KDa）的相對(duì)表達(dá)量，拍照，灰度分析，計(jì)算PAR-2蛋白表達(dá)水平的相對(duì)抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，使用SPSS 12.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

FAM熒光標(biāo)記陰性對(duì)照siRNA分別以20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L和100 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h各濃度組在倒置熒光顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有點(diǎn)狀綠色熒光出現(xiàn)，表明轉(zhuǎn)染成功。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)量和熒光細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示40 nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染時(shí)效率最高，約為70%。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇40 nmol/L作為siRNA的轉(zhuǎn)染濃度（圖1）。

圖1 陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況（熒光顯微鏡，40×）Fig.1 The transfection efficiency in control group(fluorescence microscopy,40×)

2.2 RT-PCR檢測(cè)siRNA干擾后對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2 mRNA表達(dá)的影響

與未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞比較，siRNA1、siRNA2和siRNA3轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞48 h后對(duì)PAR-2的mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均具有抑制作用，siRNA2的作用效果最明顯（P2<0.01，P1、P3均<0.05）（圖 2）。

圖2 各組細(xì)胞PAR-2的mRNA表達(dá)Fig.2 The mRNA expression of PAR-2 in each groups

2.3 Western blot檢測(cè)siRNA干擾后對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2蛋白表達(dá)的影響

與未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞比較，不同的siRNA對(duì)目的基因均具有抑制效果，其中siRNA序列2對(duì)目的基因的抑制作用最明顯（P2<0.01，P1、P3均<0.05）（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞PAR-2的蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of PAR-2 in each groups

3 討論

人體皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞是紫外線(xiàn)輻射損傷的靶點(diǎn)。已有研究表明，中波紫外線(xiàn)(UVB)可誘導(dǎo)HKC分泌多種細(xì)胞因子及表達(dá)某些自身抗原，進(jìn)而引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)[4-5]。人角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚受到外界刺激后，參與機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)[6-7]。炎癥信號(hào)常由人角質(zhì)形成細(xì)胞最先發(fā)出，并通過(guò)接受各種外界刺激，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的炎癥信號(hào)傳遞機(jī)制，表達(dá)和分泌許多重要的炎癥細(xì)胞因子，如IL-1IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF等，將外界刺激信號(hào)向其他免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)傳遞[8-9]。

PAR-2分子存在于不同系統(tǒng)的多種類(lèi)型的細(xì)胞中，參與多種生理和病理過(guò)程，通過(guò)介導(dǎo)激活Rho蛋白家族的功能，完成細(xì)胞的吞噬功能。Scott等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，人角質(zhì)形成細(xì)胞中偶聯(lián)G蛋白的PAR-2激活后，能激活GTP結(jié)合蛋白R(shí)ho家族分子，激活的Rho通過(guò)參與細(xì)胞骨架的重塑來(lái)介導(dǎo)吞噬過(guò)程，從而啟動(dòng)角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)黑素小體的吸收，促進(jìn)黑素由MC的樹(shù)突向角質(zhì)形成細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，PAR-2可表達(dá)于整個(gè)表皮層；體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，其PAR-2的酶切激活能力增強(qiáng)，從而增強(qiáng)色素轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，在組織損傷時(shí)期，PAR-2作為損傷性因子可引發(fā)炎癥反應(yīng)，而皮膚炎癥反應(yīng)中PAR-2、胰蛋白酶和/或類(lèi)胰蛋白酶表達(dá)的增加，可能會(huì)促進(jìn)炎癥皮膚部位的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，皮膚炎癥后的色素沉積與PAR-2及胰蛋白酶的表達(dá)增加有關(guān)。所以，有可能通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2基因的表達(dá)，而達(dá)到減少色素沉著的目的。

Gil等發(fā)現(xiàn)向哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染大于29 nt的長(zhǎng)dsRNA時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生非特異性的基因沉默。Elbashir等[12]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染21 nt的siRNA近似物，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，且不激活PKR途徑，因而不會(huì)導(dǎo)致非特異性的基因沉默。所以，有研究嘗試通過(guò)化學(xué)合成19～21 nt的siRNA類(lèi)似物，然后再轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)RNAi，并取得成功?；瘜W(xué)合成法成本高于其他方法，而且周期較長(zhǎng)，根據(jù)不同的合成和純化要求需4～12 d。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，只需根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)2～4條siRNA序列，然后進(jìn)行合成，合成的siRNA可直接轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。與核酶及反義RNA相比，siRNA抑制效率更高、特異性更好；與載體siRNA相比，化學(xué)合成siRNA純度高，更具實(shí)用性及開(kāi)發(fā)前景。然而，化學(xué)合成的siRNA也有著自身的缺點(diǎn)，即只能產(chǎn)生短暫（通常1～2周）的效應(yīng)，并且對(duì)靶mRNA的特定序列有著很強(qiáng)的選擇偏向性，需要多次實(shí)驗(yàn)才能篩選出有較強(qiáng)作用的siRNA。

RNA干擾的靶位識(shí)別是一個(gè)有著高度序列特異性的過(guò)程，同一mRNA內(nèi)不同部位核苷酸組成的siRNA會(huì)產(chǎn)生不同的基因沉默效應(yīng)，siRNA的有效性高度依賴(lài)于靶點(diǎn)位置[13-14]。Holen等[14]的實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的siRNA只有部分能有效抑制基因表達(dá)，不同靶點(diǎn)的抑制效果不同。即便僅1個(gè)核苷酸的改變，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都有可能檢測(cè)不到靶基因的RNA干擾現(xiàn)象。Yoshinari等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，即使siRNA的序列起始位置只錯(cuò)后1或2個(gè)堿基，其抑制效果也大大降低。因此，在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，siRNA序列的選擇極其重要。我們用Ambion公司在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件確定針對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2基因的特異靶序列，設(shè)計(jì)選取了3條siRNA。本研究證實(shí)選取合適的siRNA序列可以有效地抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2基因的表達(dá)，為后續(xù)應(yīng)用RNAi技術(shù)研究黑色素傳輸機(jī)制以及如何減少色素沉著奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Seiberg M,Paine C,Sharlow E,et al.The protease-activated receptor 2 regulates pigmentation via keratinocyte-melanocyte interactions[J].Exp Cell Res,2000,254(1):25-32.

[2]Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[3]Brantl S.Antisense-RNA regulation and RNA interference[J].Biochem Biophys Acta,2002,1575(1-3):15-25.

[4]Yarosh D,Both D,Kibitel J,et al.Regulation of TNF α production and release in human and mouse skin after UVB irradiation[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,2000,16(6):263-270.

[5]Grewe M,Gyufko K,Krutmann J.Interleukin-10 production by cultured human keratinocytes:regulation by ultraviolet B and ultraviolet A1 radiation[J].Invest Dermatol,1995,104(1):3-6.

[6]Kondo S.The roles of keratinocyte-derived cytokines in the epidermis and their possible responses to UVA-irradiation[J].Invest Dermatol Symp Proc,1999,4(2):177-183.

[7]Clingen PH,Berneburg M,Petit-Frere C,et al.Contrastiong effects of an ultraviolet B and A tanning lamp on Interleukin 6,tumour necrosis factor-alpha and intercellular adhesion molecu-lar-1 expression[J].Br J Dermatol,2001,145(1):54-62.

[8]Kondo S.The roles of cytokines in photoaging[J].Dermatol Sci,2000,23(1):S30-S36.

[9]Park KC,Jung HC,Hwang JH,et al.GM-CSF production by epithelial cell line:upregulation by ultraviolet A[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed,1997,13(4):133-138.

[10]Scott G,Leopardi S,Parker L,et al.The proteinase-activated receptor-2 mediates phagocytosis in a Rho-dependent manner in human keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2003,121(3):529-541.

[11]Scott G,Deng A,Rodriguez-Burford C,et al.Protease activated receptor2,a receptor involved in melanosome transfer,is up regulated in human skin by ultraviolet irradiation[J].J Invest Dermatol,2001,117(6):1412-1420.

[12]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[13]Elbashir SM,Harborth J,Weber K,et al.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs[J].Methods,2002,26(2):199-213.

[14]Holen T,Amaizguioui M,Weiger MT,et al.Positional effects of short interfering RNA targeting the human coagulation trigger tissue factor[J].Nucleic Acids Res,2002,30(8):1757-1766.

[15]Yoshinari K,Miyagishi M,Taira K,et al.Effects on RNAi of the tight structure,sequence and position of the targeted region[J].Nucleic Acids Res,2004,32(2):691-699.