P17-BMP2多肽促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究

李佳濱 張文杰 崔福齋 杜曉巖

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種存在于骨髓內(nèi)的成體干細(xì)胞，因具有多向分化潛能和高增殖活性，目前已成為骨組織工程中理想的種子細(xì)胞。BMSCs可在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下向成骨細(xì)胞分化[1]。研究證實(shí)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）是目前成骨誘導(dǎo)活性最強(qiáng)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一，屬于TGF-β超家族成員[2]。因純化天然BMP2程序復(fù)雜，不易獲得，所以基因重組的BMP2研發(fā)是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)BMP-2的核心功能區(qū)氨基酸序列，合成一條含有17個(gè)核苷酸的P17-BMP2，旨在觀察P17-BMP2聯(lián)合成骨誘導(dǎo)劑促使BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

P17-BMP2多肽（清華大學(xué)合成提供）；DMEMLG培養(yǎng)基、DMEM-HG培養(yǎng)基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素、特級胎牛血清(Gibco公司，美國)；β-甘油磷酸二鈉（Sigma 公司，美國）；地塞米松（Sigma公司，美國）；抗壞血酸（Sigma公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；CCK-8 試劑（日本同仁化學(xué)研究所）；熒光顯微鏡（Olympus IX70，日本）；核酸蛋白分析儀（DU-800，美國）；熒光定量PCR儀（MX3000P，美國）；高速冰凍離心機(jī)（Beckman 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離培養(yǎng)及分組

取4周齡Wistar雄性大鼠9只（上海第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒5min，無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，剪除骨端，止血鉗壓碎，5 mL的DMEM完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，100 mg/mL青、鏈霉素）沖洗骨髓腔，使骨髓細(xì)胞充分分散，將收集的骨髓用吸管打勻，加入離心管，1500 r/min離心5min，棄上清，用適量DMEM打勻制成單細(xì)胞懸液，取懸液1 mL（1只大鼠一培養(yǎng)皿）至 25 cm培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5%CO2孵育箱中，48 h后換液，以后每 3天換液1次。待細(xì)胞匯合成80%～90%單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，取第3代的細(xì)胞備用。

分4組培養(yǎng)：對照組（A組）、成骨誘導(dǎo)組（B組）、成骨誘導(dǎo)+P17-BMP2組（C組）、單純P17-BMP2組（D組）。A組：采用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組：含地塞米松10-7mol/L、Vit C 10 mg/L及β-甘油磷酸鈉（β-sodium glycerophosphate，β-GP）10 mmol/L 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；C組：成骨誘導(dǎo)液+P17-BMP2（10 μg/mL）培養(yǎng)；D 組：含 P17-BMP2（10 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖測定

取第3代對數(shù)生長期的BMSCs離心稀釋吹打成濃度為1×104cells/mL的均勻單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液量為100μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立空白對照孔（加培養(yǎng)基100μL），孔板周圍加PBS 100μL保持濕度。共接種4個(gè)96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，以后3 d換液一次，于培養(yǎng)第1、3、5、7天取出，每孔加入CCK-8試劑10μL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組的吸光光度值，取3個(gè)孔OD平均值，檢測波長為450 nm。采集3只大鼠的骨髓重復(fù)3次。

1.2.3 堿性磷酸酶染色

取第3代細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，各組培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。PBS洗滌3次，放置4℃固定液，流水沖洗，晾干；將二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入緩沖液中；再加入固紫B混勻；將工作液置于37℃水溫箱45min，流水沖洗；顯微鏡觀察。采集3只大鼠的骨髓重復(fù)3次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)NCBI Genebank序列行引物設(shè)計(jì)，引物由上海英濰捷基有限公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測，開蓋前短暫離心，加入經(jīng)DEPC處理的ddH2O稀釋至濃度為 10 nmol/μL，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。OPN引物序列：Forward primer 5-CATCAGAGCCACGAGTTTCA-3；Reverse primer 5-TCAGGGCCCAAAACACTATC-3；OCN引物序列：Forward primer 5-TGCCTTCTGTCTGGGTGTCC-3；Reverse primer 5-GCTGTGCCGTCCATACTTTCG-3；Runx2引物序列 ：Forward primer 5-CAACATCTCCACATCATTAG-3；Reverse primer 5-TTATTACCCTCTCAAACACTG-3；β-Actin引物序列：Forward primer 5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTA -3；Reverse primer 5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。

培養(yǎng)7 d、14 d后分別收集細(xì)胞，使用Trizol一步法抽提細(xì)胞總RNA。每組各3個(gè)復(fù)孔，Q-PCR重復(fù)檢測。采集3只大鼠的骨髓重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，將以上數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs形態(tài)學(xué)特征

熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞接種24h即可貼壁，48 h后細(xì)胞貼壁呈成纖維細(xì)胞樣外觀，3～7 d細(xì)胞處于對數(shù)生長期，增殖明顯，呈單層生長。C組用含P17-BMP2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d后，細(xì)胞形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓或多角形，出現(xiàn)無規(guī)則堆積，融合生長時(shí)細(xì)胞變短，形態(tài)扁平，核及核仁清晰可見（圖 1）。

圖1 各組BMSCs體外誘導(dǎo)7 d后的組織學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1 The histological observation of BMSCs in each group 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.2 細(xì)胞增殖測定

細(xì)胞培養(yǎng)第 1、3、5、7天時(shí)，通過 CCK-8對大鼠BMSCs增殖進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與A組相比，D組對大鼠BMSCs增殖無影響，而B組對BMSCs細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用，C組細(xì)胞增殖能力顯著提高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在增殖第7天時(shí)，成骨誘導(dǎo)組對細(xì)胞增殖作用不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（圖 2）。

2.3 堿性磷酸酶染色

體外誘導(dǎo)7 d，各組堿性磷酸酶染色均為陽性，但染色強(qiáng)度有差異，C組>B組>D組>A組。顯微鏡下觀察可見陽性區(qū)域胞質(zhì)內(nèi)有紫色顆粒（圖3）。

圖2 各組細(xì)胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve of each group

圖3 各組BMSCs體外誘導(dǎo)7 d后AKP染色大體觀及鏡下觀察（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.3 The gross and histological observation of BMSCs by AKP staining 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖4 各組BMSCs體外培養(yǎng)第7、14天成骨特異性基因OPN、OCN、Runx2的表達(dá)Fig.4 The expression of OPN,OCN and Runx2 of each group at the 7th and 14th day after induction

2.4 Q-PCR檢測OCN、OPN、Runx2的mRNA表達(dá)

Q-PCR結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)第7天，B、C、D組均表達(dá)成骨特異性基因，與對照組相比，B組和C組中所有檢測基因的表達(dá)均顯著提高（P<0.05），而D組與對照組相比無顯著差異。在誘導(dǎo)第14天時(shí)，B組和C組中所有檢測基因與對照組相比有顯著差異（P<0.05）；D組與對照組相比，OCN和OPN的表達(dá)有顯著差異（P<0.05）（圖4）。

3 討論

BMP2屬于TGF-β超家族中的一員，因其誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)，可促進(jìn)骨形成并分泌特異性成骨細(xì)胞產(chǎn)物，如 COL、OPN、OCN 等。研究表明，BMP-2的信號傳導(dǎo)通過Smads途徑或MAPK途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx，從而啟動(dòng)成骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)[3-4]。以往研究表明，在成骨過程中，BMSCs在局部BMP2的刺激下發(fā)生化學(xué)趨向、聚集、分化形成軟骨和骨[5-6]。天然人BMP2成熟肽由114個(gè)氨基酸組成，但真正發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用的只是由20余個(gè)氨基酸組成的核心結(jié)構(gòu)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因重組技術(shù)的成功應(yīng)用，解決了BMPs生產(chǎn)成本高和產(chǎn)量低的問題。近10年來，人們利用分子基因工程和生物學(xué)等技術(shù)開展了基因重組BMP2的工作，但目前重組BMP2臨床使用費(fèi)用高，提取方法繁雜，而且存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，難以滿足臨床和研究的需求。本實(shí)驗(yàn)中P17-BMP2的核心功能區(qū)是由17個(gè)氨基酸組成的寡肽BMP2，其活性點(diǎn)易于暴露，合成方法簡單，可以通過特定的細(xì)胞通訊與信息傳遞對細(xì)胞的成骨定向分化起調(diào)控作用，具有一定骨誘導(dǎo)性。與rhBMP-2相比較，短鏈多肽相對于蛋白質(zhì)有很多優(yōu)點(diǎn)：①小分子的多肽可以用多肽合成儀快速大規(guī)模地制備，克服基因工程技術(shù)合成大分子蛋白質(zhì)時(shí)工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴的弊端；②小分子多肽結(jié)構(gòu)簡單，其活性位點(diǎn)暴露充分，并易與細(xì)胞的受體充分結(jié)合，易于合成，能生產(chǎn)出不同劑型的多肽，且生物學(xué)活性和穩(wěn)定性較好。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P17-BMP2具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用，并篩選出P17-BMP210 μg/mL的劑量對大鼠BMSCs的成骨分化作用最為明顯。大多數(shù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中使用的 BMP2 為 20～200 μg/mL[7-9]，段智霞等[10]研究顯示P24-BMP2活性多肽在體外能誘導(dǎo)BMSCs向成骨方向分化，最佳劑量為200 μg/mL，低于此劑量誘導(dǎo)效果不明顯，高于此劑量誘導(dǎo)效果無明顯增強(qiáng)，而副作用增加明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往實(shí)驗(yàn)相似。

BMSCs成骨誘導(dǎo)的方法很多，既往的研究已證明，BMSCs在礦化培養(yǎng)基（地塞米松、甘油磷酸鈉和L-抗壞血酸）培養(yǎng)下可向成骨細(xì)胞分化。含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉和L-抗壞血酸的礦化培養(yǎng)基（OS培養(yǎng)基）[11]被認(rèn)為是經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。Rickard等[12]研究表明，BMP和DEX的聯(lián)合作用比單純使用BMP的骨誘導(dǎo)性高，認(rèn)為BMP可能并不單獨(dú)發(fā)生作用，在整個(gè)骨誘導(dǎo)過程中可能需要激素的協(xié)同作用?；谝陨辖Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)中將P17-BMP2與成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)組和單純P17-BMP2組在第7天、第14天表達(dá)成骨特異性基因OCN、OPN及Runx2，當(dāng)P17-BMP2與成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)成骨特異性基因OCN、OPN及Runx2的表達(dá)與其他各組都有顯著性差異。這說明在成骨分化中P17-BMP2與成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合應(yīng)用比單純應(yīng)用P17-BMP2因子的骨誘導(dǎo)性高，并可上調(diào)特異性成骨細(xì)胞產(chǎn)物OCN、OPN及Runx2的mRNA表達(dá)，體外誘導(dǎo)7 d后堿性磷酸酶染色結(jié)果同樣證實(shí)了這一點(diǎn)。為了能更好證明P17-BMP2多肽的骨誘導(dǎo)活性和成骨作用，我們下一步實(shí)驗(yàn)將以P17-BMP2復(fù)合在生物支架材料上，觀察其在體內(nèi)的異位成骨能力。

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