尚旭嵐，徐錫增，方升佐

(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京210037)

酚酸是指帶有酚類基團(tuán)的有機(jī)酸，是植物在生命活動過程中產(chǎn)生的一類重要次生代謝產(chǎn)物，也是植物體中化感活性較強(qiáng)的一類成分。香草酸(vanillic acid)是植物體中常見的酚酸類成分之一。很多學(xué)者從植物的莖、葉、根等器官［1－3］或含有植物殘體的土壤［4－6］中分離出香草酸并對其進(jìn)行了化感作用方面的研究，也有學(xué)者從植物種子中分離出香草酸并對其進(jìn)行了種子萌發(fā)抑制作用方面的研究［7－10］，但有關(guān)香草酸抑制植物生長及種子萌發(fā)的作用機(jī)制方面的研究報道尚不多見［10］。

青錢柳〔Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.〕又稱搖錢樹、麻柳，為胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya Iljinsk.)植物，是中國特有的單種屬植物，也是國家重點保護(hù)野生植物之一。青錢柳具有較高的藥用、保健、材用和觀賞等價值，是極具開發(fā)利用前景的珍貴樹種。但由于青錢柳種子發(fā)育差并具有深休眠特性，因此天然更新困難，大量人工栽培也受到嚴(yán)重阻礙［11］。

前期研究結(jié)果表明:青錢柳種皮中含有的一些內(nèi)源抑制物質(zhì)可能是導(dǎo)致青錢柳種子休眠和幼苗生長受阻的原因之一［12］。采用系統(tǒng)溶劑法對抑制活性最強(qiáng)的青錢柳種皮甲醇提取液進(jìn)行分離，其乙醚相的抑制活性最強(qiáng)，在乙醚相中香草酸的相對含量最高，達(dá)到35.09%，生物測定結(jié)果顯示香草酸對不結(jié)球白菜(Brassica campestris subsp.chinensis Makino)種子幼根生長有較強(qiáng)的抑制作用［13］;香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)和胚根伸長生長都有較強(qiáng)的抑制作用，其對青錢柳種子萌發(fā)的半抑制濃度為 81.33 mg·L－1［14］。但香草酸對青錢柳種子萌發(fā)的抑制作用機(jī)制并不清楚，也未見相關(guān)的研究報道。

作者將青錢柳離體胚接種到添加半抑制濃度(81.33 mg·L－1)香草酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并定期取樣，對青錢柳離體胚萌發(fā)過程中相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化以及各生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，以期更深入地了解香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)的抑制作用機(jī)制，為打破青錢柳種子休眠技術(shù)的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2006年11月在云南昆明植物園內(nèi)采集成熟的青錢柳種子，千粒質(zhì)量為108.45 g，飽滿率63%。種子去翅后采用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇進(jìn)行分選，選取下沉種子并晾干，使其飽滿率達(dá)到90%。種子晾干后用透氣的塑料籃子盛裝，保存于室內(nèi)陰涼、避光處待用。實驗于2006年12月進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 離體胚的處理及培養(yǎng)方法 首先采用過濾滅菌法對香草酸母液(質(zhì)量濃度50 g·L－1，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇配制)進(jìn)行滅菌處理，向已滅菌并冷卻至約50℃的空白培養(yǎng)基(僅含8 g·L－1瓊脂，pH 5.95～pH 6.00)中添加一定體積的香草酸母液，配制成含81.33 mg·L－1(半抑制濃度，IC50)香草酸的培養(yǎng)基，對照則加入等體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，逐管分裝。

青錢柳種子用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇處理1 min后，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2%HgCl2浸泡20 min，無菌水沖洗5～6次，然后用無菌水浸泡96 h后再進(jìn)行常規(guī)消毒;先用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇處理1 min，再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2浸泡6.5 h。從已消毒種子中剝?nèi)≥^完整的離體胚分別接種到香草酸處理組和對照組培養(yǎng)基上。每管接種1個離體胚，每處理200管，各重復(fù)3次，每處理共計600管。置于溫度(25±2)℃、光照時間12 h·d－1、光照度1 500～2 000 lx的條件下分別培養(yǎng)0、3、6、9和12 d后取樣測定各項生理生化指標(biāo)。將離體胚從試管中取出后用蒸餾水洗凈并吸干表面水分(培養(yǎng)0 d的離體胚直接從種子中剝?nèi)?，根據(jù)測定指標(biāo)樣品量的要求準(zhǔn)確稱量后分裝并置于液氮內(nèi)速凍1 min，然后置于－70℃低溫冰箱保存、備用、待測。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測定方法 測定指標(biāo)分別為粗脂肪、可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)含量;異檸檬酸裂合酶(ICL)、過氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(AP)和堿性磷酸酶(ALP)活性;葡萄糖－6－磷酸脫氫酶(G－6－PDH)和6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6－PGDH)聯(lián)合活性。采用索氏提取法［15］184－185測定粗脂肪含量(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計);將提取粗脂肪后的樣品烘干，采用蒽酮比色法［16］195－197測定可溶性糖和淀粉含量;采用考馬斯亮藍(lán) G－250 染色法［16］184－185測定蛋白質(zhì)含量;參照宋松泉等［17］80－82和邢更妹等［18］的方法測定 ICL 活性;參照文獻(xiàn)［19］的方法測定G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性;采用愈創(chuàng)木酚法［16］164－165測定 POD 活性;參照宋松泉等［17］79－80的方法測定 AP 活性;參照文獻(xiàn)［20］的方法測定ALP活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、差異顯著性分析和相關(guān)性分析。將香草酸處理組和對照組所有同時段同一指標(biāo)的測定數(shù)據(jù)合并后進(jìn)行生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)過程中部分生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 對貯藏物質(zhì)含量的影響 在添加了半抑制濃度(81.33 mg·L－1)香草酸的培養(yǎng)基上，青錢柳離體胚萌發(fā)過程中粗脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉和可溶性糖4種主要貯藏物質(zhì)含量的變化見表1。

表1 香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)含量的影響1)Table 1 Effect of vanillic acid on content of storage substances in embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

由表1可見:隨培養(yǎng)時間的延長，青錢柳離體胚的粗脂肪和蛋白質(zhì)含量基本上呈不斷下降的趨勢，香草酸處理組的粗脂肪和蛋白質(zhì)含量變幅比對照組小且在各培養(yǎng)時間都高于對照組。在培養(yǎng)前6天內(nèi)，對照組及處理組的粗脂肪含量均小幅下降;培養(yǎng)第9天時對照組的粗脂肪含量迅速下降，至第12天粗脂肪含量僅為8.23%;而培養(yǎng)第9天處理組的粗脂肪含量僅略有降低，培養(yǎng)第12天處理組的粗脂肪含量雖然明顯降低但仍高達(dá)21.62%，且培養(yǎng)第9天和第12天處理組離體胚的粗脂肪含量均顯著高于對照組。培養(yǎng)第3天對照組離體胚的蛋白質(zhì)含量比接種初期降低了27.9%，培養(yǎng)第9天時較初期降低了67.4%，培養(yǎng)第12天時則較第9天略有增加;而處理組的蛋白質(zhì)含量則不斷降低，且與同期對照組的蛋白質(zhì)含量均有顯著差異(P＜0.05)。

由表1還可見:隨著培養(yǎng)時間的延長，香草酸處理組和對照組青錢柳離體胚的淀粉和可溶性糖含量均呈先降低后升高的變化趨勢。在培養(yǎng)前6天內(nèi)，處理組和對照組的淀粉含量均較初期略有降低但二者的差異基本不顯著;而培養(yǎng)第9天和第12天處理組和對照組的淀粉含量均顯著提高，至培養(yǎng)結(jié)束時二者的淀粉含量均達(dá)到最高，且處理組的淀粉含量顯著低于對照組。在培養(yǎng)前6天內(nèi)，處理組和對照組離體胚的可溶性糖含量急劇降低，均在第6天降至最低，其中第3天時處理組的可溶性糖含量顯著高于對照組(P＜0.05);隨后可溶性糖含量不斷增加，至培養(yǎng)結(jié)束時二者的可溶性糖含量均達(dá)到最高，且處理組的可溶性糖含量顯著高于對照組 (P＜0.05)。

差異顯著性分析結(jié)果表明:培養(yǎng)12 d時，香草酸處理組和對照組青錢柳離體胚的粗脂肪和蛋白質(zhì)含量均顯著低于接種初期，而淀粉和可溶性糖含量則顯著高于接種初期;在培養(yǎng)3～12 d內(nèi)，香草酸處理組和對照組離體胚中前述4種貯藏物質(zhì)的含量大多與接種初期有顯著差異。

2.1.2 對一些酶活性的影響 在添加了半抑制濃度(81.33 mg·L－1)香草酸的培養(yǎng)基上，青錢柳離體胚萌發(fā)過程中一些酶活性的變化見表2和表3。

由表2可見:隨著培養(yǎng)時間的延長，香草酸處理組和對照組離體胚的異檸檬酸裂合酶(ICL)活性均呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，但整體上看，同一時段對照組離體胚的ICL活性顯著高于處理組(P＜0.05)。在培養(yǎng)第6天，對照組離體胚的ICL活性開始大幅度提高，且與處理組間的差異達(dá)顯著水平，在培養(yǎng)第12天，對照組離體胚的ICL活性為培養(yǎng)初期的56.5倍;而處理組離體胚的ICL活性在培養(yǎng)第9天才大幅度提高，至培養(yǎng)第12天時其ICL活性仍小于對照組，并且也小于培養(yǎng)第6天對照組的ICL活性水平。

由表2還可見:在培養(yǎng)前6天，對照組青錢柳離體胚的葡萄糖－6－磷酸脫氫酶(G－6－PDH)和6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6－PGDH)聯(lián)合活性變化不明顯，在培養(yǎng)第9天時達(dá)到最高且與處理組間差異顯著(P＜0.05)，在培養(yǎng)第12天有所降低。處理組離體胚的G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性則從培養(yǎng)第6天開始一直上升，到第12天時達(dá)到最高，其活性水平與培養(yǎng)第9天時對照組的活性相近，這可能與處理組離體胚萌發(fā)受阻導(dǎo)致PPP途徑活化推遲有關(guān)。

表2和表3的數(shù)據(jù)還表明:隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組和處理組青錢柳離體胚的過氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(AP)和堿性磷酸酶(ALP)活性均呈逐漸提高的趨勢;在培養(yǎng)第12天，處理組青錢柳離體胚的POD活性顯著高于對照(P＜0.05)，而其AP和ALP活性則顯著低于對照。同一培養(yǎng)時段，對照組離體胚的AP和ALP活性大于處理組且增幅更大。在培養(yǎng)的第6天和第9天，處理組離體胚的ALP活性均顯著低于對照組。

表2 香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)過程中一些酶活性的影響1)Table 2 Effect of vanillic acid on some enzyme activities of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

表3 香草酸對青錢柳離體胚萌發(fā)過程中2種磷酸酶活性的影響1)Table 3 Effect of vanillic acid on two phosphatase activities of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

差異顯著性分析結(jié)果表明:在培養(yǎng)的第12天，香草酸處理組和對照組青錢柳離體胚的ICL、POD、AP和ALP活性以及香草酸處理組青錢柳離體胚的G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性均顯著高于接種初期(P＜0.05)。

2.2 青錢柳離體胚萌發(fā)過程中部分生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

青錢柳離體胚萌發(fā)過程中粗脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉和可溶性糖含量及ICL、POD、AP和ALP活性以及G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性間的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

由表4可見:青錢柳離體胚萌發(fā)過程中粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量與5個酶活性指標(biāo)間均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，粗脂肪含量還與蛋白質(zhì)含量和淀粉含量分別呈極顯著正相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)，蛋白質(zhì)含量還與淀粉含量和可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān);淀粉含量與可溶性糖含量、ICL活性、G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性、POD活性和ALP活性均呈顯著或極顯著正相關(guān);可溶性糖含量與ICL活性以及G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性呈極顯著正相關(guān);ICL活性與G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性、POD活性、AP活性及ALP活性均呈顯著或極顯著正相關(guān);G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性與POD活性呈極顯著正相關(guān);POD活性與AP活性及ALP活性均呈極顯著正相關(guān);AP活性與ALP活性也呈極顯著正相關(guān)。

表4 青錢柳離體胚萌發(fā)過程中部分生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析1)Table 4 Correlation analysis among some physiological-biochemical indexes of embryos in vitro of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk.during germination process1)

3 討論和結(jié)論

酚酸是一類重要的抑制植物種子萌發(fā)的成分，能夠抑制自身和其他植物種子的萌發(fā)和生長，進(jìn)而產(chǎn)生自毒效應(yīng)和他感作用。相關(guān)研究表明:酚酸類成分主要通過阻礙氣體交換、水分吸收、蛋白質(zhì)合成［9］和酶活化［4－5］等生理活動對植物種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。

在種胚萌發(fā)過程中，隨著細(xì)胞含水量的增加，各種受阻抑的代謝過程逐步恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生一系列生理生化變化，呼吸作用增強(qiáng)、各類貯藏物質(zhì)被分解并轉(zhuǎn)化為可利用的物質(zhì)后運轉(zhuǎn)到生長部位，作為幼胚生長的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。脂肪是青錢柳種子中最主要的貯藏物質(zhì)，含量約50%［21］。本研究結(jié)果表明:受香草酸抑制作用的影響，在萌發(fā)過程中香草酸處理組青錢柳離體胚的粗脂肪含量均高于對照組，說明處理組的離體胚中脂肪降解較少，而對照組離體胚中的脂肪則能順利降解。

Baleroni等［22］的研究結(jié)果顯示:阿魏酸和香豆酸能降低脂肪代謝活性，阻止油菜(Brassica napus L.)種子萌發(fā);Muscolo等［5］認(rèn)為:脂肪是南歐黑松(Pinus laricio Poir.)種子中的主要貯藏物質(zhì)，酚酸類物質(zhì)可抑制脂肪代謝途徑中異檸檬酸裂合酶(ICL)的活性從而影響種子的萌發(fā)。本研究也得到類似的實驗結(jié)果。本研究結(jié)果表明:對照組和香草酸處理組的青錢柳離體胚中粗脂肪含量不斷降低，與此相對應(yīng)的是離體胚的ICL活性從培養(yǎng)第6天開始迅速提高，且對照組的ICL活性顯著高于處理組，說明培養(yǎng)基中添加的香草酸抑制了青錢柳離體胚中ICL的活化從而使脂肪不能順利降解，影響離體胚的萌發(fā)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明:在青錢柳離體胚的萌發(fā)過程中，粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量除與ICL活性有顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系外，還與 G－6－PDH和6－PGDH聯(lián)合活性以及POD活性、酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性有顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明青錢柳離體胚萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與酶的活化緊密相關(guān)。

綜上所述，在培養(yǎng)基中添加半抑制濃度(81.33 mg·L－1)香草酸能夠抑制青錢柳離體胚萌發(fā)過程中各種酶的活化，導(dǎo)致主要貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化受阻，從而影響胚的萌發(fā)。

［1］SAMPIETRO D A，VATTUONE M A，ISLA M I.Plant growth inhibitors isolated from sugarcane(Saccharum officinarum)straw［J］.Journal of Plant Physiology，2006，163(8):837－846.

［2］鄔彩霞.幾種豆科牧草化感作用的比較研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，2007.

［3］甄文超，王曉燕，孔俊英，等.草莓根系分泌物和腐解物中的酚酸類物質(zhì)及其化感作用［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27(4):74－78.

［4］MUSCOLO A，PANUCCIO M R，SIDARI M.Glyoxylate cycle in germination of Pinus laricio seeds:effects of phenolic compounds extracted from different forest soils［J］.Plant Growth Regulation，2002，37(1):1－5.

［5］MUSCOLO A，PANUCCIO M R，SIDARI M.The effect of phenols on respiratory enzymes in seed germination.Respiratory enzyme activities during germination of Pinus laricio seeds treated with phenols extracted from different forest soils［J］.Plant Growth Regulation，2001，35(1):31－35.

［6］ISHIKURA Y，KOJIMA Y，TERAZAWA M.Effects of phenolic compounds on seed germination ofshirakamba birch Betula platyphylla var.japonica［J］.Eurasian Journal Forest Research，2001，2:17－25.

［7］GALLAGHER R S，ANANTH R，GRANGER K.Phenolic and short-chained aliphatic organic acid constituents of wild oat(Avena fatua L.)seeds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(1):218－225.

［8］GATFORD K T，EASTWOOD R F，HALLORAN G M.Germination inhibitors in bracts surrounding the grain of Triticum tauschii［J］.Functional Plant Biology，2002，29(7):881－890.

［9］SIDDIQUI Z S，KHAN M A.The role of seed coat phenols on water uptake and early protein synthesis during germination of dimorphic seeds of Halopyrum mucronatum(L.)Staph［J］.Pakistan Journal of Botany，2010，42(1):227－238.

［10］NAQVI H H，HANSON G P.Germination and growth inhibitors in guayule(Parthenium argentatum Gray)chaff and their possible influence in seed dormancy［J］.American Journal of Botany，1982，69(6):985－989.

［11］方升佐，洑香香.青錢柳資源培育與開發(fā)利用的研究進(jìn)展［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，31(1):95－100.

［12］楊萬霞，方升佐.青錢柳種皮甲醇浸提液的生物測定［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報，2005，14(4):11－14.

［13］尚旭嵐，徐錫增，方升佐.青錢柳種子休眠機(jī)制［J］.林業(yè)科學(xué)，2011，47(3):68－74.

［14］SHANG X L，XU X Z，F(xiàn)ANG S Z.Identification and quantitative analysis of germination inhibitors in the pericarp of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskata［J］.Propagation of Ornamental Plants，2012，12(4):195－201.

［15］中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會.現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［16］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［17］宋松泉，程紅焱，龍春林，等.種子生物學(xué)研究指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2005.

［18］邢更妹，薛 榮，王倉山.紅芪組織培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物的研究Ⅰ.紅芪愈傷組織異檸檬酸裂解酶活性的變化［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1999，35(2):119－123.

［19］浦心春，韓建國，李 敏.結(jié)縷草種子打破休眠過程中的代謝調(diào)控［J］.中國草地學(xué)報，1994，16(3):20－24.

［20］董建華，楊華庚，王秉忠.橡膠種子不同萌發(fā)期幾種酶及可溶性蛋白質(zhì)的變化［J］.熱帶作物學(xué)報，1998，19(3):1－7.

［21］FANG S Z，WANG J Y.Changes in the biochemical composition and enzyme activity during dormancy release of Cyclocarya paliurus seeds［J］.Forestry Studies in China，2007，9(1):7－13.

［22］BALERONI C R S，F(xiàn)ERRARESE M L L，SOUZA N E，et al.Lipid accumulation during canola seed germination in response to cinnamic acid derivatives［J］.Biologia Plantarum，2000，43(2):313－316.