德宏水牛及其雜交后代染色體多態(tài)性分析

宋敏艷，高文春，尹正發(fā)，楊明超，佴文惠，胡 怡，毛華明，4，史憲偉＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201；2.云南省盈江縣畜牧獸醫(yī)局，云南 盈江679300；3.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650223；4.云南省反芻動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，云南 昆明650201）

德宏水牛主產(chǎn)于云南省西部德宏地區(qū)盈江縣、瑞麗市、潞西市、隴川縣、梁河縣和保山、臨滄等地區(qū)的15個(gè)縣市，是全國(guó)優(yōu)良地方八大水牛品種之一，素以體型大、體質(zhì)強(qiáng)健、性情溫馴、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)、產(chǎn)肉性能高而出名［1］。

德宏水牛為役用型水牛，產(chǎn)奶產(chǎn)肉能力較低［2］。自1987年實(shí)施“中—?dú)W德宏水牛開發(fā)項(xiàng)”以來(lái)，為提高德宏水牛的奶肉生產(chǎn)性能，引入印度摩拉水牛與巴基斯坦的尼里·拉菲水牛對(duì)德宏水牛進(jìn)行了大規(guī)模的雜交改良［3］。到2009年末，德宏水牛存欄數(shù)10.20萬(wàn)頭，其中已使用凍精配種1.23萬(wàn)多頭次，雜交水牛1.52萬(wàn)多頭，能繁母牛3.44萬(wàn)多頭［4］。通過(guò)與河流型水牛進(jìn)行雜交，雜交后代產(chǎn)奶與產(chǎn)肉性能顯著得到提高。然而，不同類型水牛雜交后代的染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)目均出現(xiàn)多態(tài)類型，研究德宏水牛及雜交后代染色體多態(tài)性遺傳規(guī)律及與生產(chǎn)性能的關(guān)系將為德宏水牛進(jìn)一步雜交改良及品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

家養(yǎng)水牛分為河流型與沼澤型水牛，河流型水牛染色體數(shù)為2n＝50，沼澤型水牛染色體數(shù)為2n＝48，兩者雜交后代可育，并且后代出現(xiàn)染色體多態(tài)性［5］。Berardino等［5］利用染色體分帶技術(shù)研究了河流型水牛與意大利沼澤型水牛染色體特征，黃右軍等［6］對(duì)廣西本地沼澤型水牛與河流型摩拉水牛的核型進(jìn)行了比較分析，其研究結(jié)果均表明：沼澤型水牛染色體數(shù)為2n＝48，摩拉水牛為2n＝50，兩種類型雜交后代染色體數(shù)為2n＝49；沼澤型水牛少了一對(duì)河流型摩拉水牛核型中的9號(hào)端著絲粒染色體；沼澤型水牛1號(hào)染色體為一大的中著絲粒染色體，推測(cè)其可能是由河流型水牛4號(hào)和9號(hào)染色體發(fā)生端粒－著絲粒串聯(lián)融合形成。除此之外，沼澤型水牛與河流型水牛的其余染色體在染色體結(jié)構(gòu)、帶型以及著絲粒和核仁組織區(qū)都完全一致，這說(shuō)明河流型水牛與沼澤型水牛染色體具有高度的同源性或一致性。

Harisah等［7］對(duì)75頭純種水牛和198頭來(lái)自菲律賓與馬來(lái)西亞的雜交水牛進(jìn)行了染色體分析。結(jié)果表明：沼澤型水牛染色體數(shù)為2n＝48，河流型水牛染色體數(shù)為2n＝50；雜交一代染色體數(shù)均為2n＝49；雜交二代產(chǎn)生三種不同的染色體核型：2n＝48，2n＝49，2n＝50；與親本回交則出現(xiàn)2n＝49和2n＝50兩種染色體核型。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，雜交二代不同核型的分離比為1∶2∶1，回交后代的核型分離比接近1∶1。黃右軍等［8］分析了河流型摩拉和尼里／拉菲水牛（2n＝50）與我國(guó)本地水牛（2n＝48）雜交后代的染色體核型，發(fā)現(xiàn)三元雜（尼里X摩雜一代／二代）出現(xiàn)2n＝49和2n＝50兩種組型，其分離比也接近1∶1。但是，德宏水牛及雜交后代染色體核型特征及多態(tài)性遺傳規(guī)律尚未見報(bào)道。

本文對(duì)采集的具有不同繁殖性能的20頭德宏本地水牛、25頭摩拉與德宏二元雜水牛以及35頭尼里與摩拉和德宏三元雜水牛進(jìn)行了染色體核型分析，以期為德宏水牛的品種保護(hù)利用及雜交改良提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)的水牛樣品來(lái)自云南省德宏傣族景頗族自治州盈江縣舊城、新城和平原3個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）。共采集了德宏本地水牛20頭（♀15頭，♂5頭），其中6歲以上并配種3次以上均未受孕母牛5頭，其余10頭母牛繁殖性能良好；摩拉與德宏二元雜交水牛25頭（♀21頭，♂4頭），其中6歲以上并配種3次以上均未受孕的11頭，其余10頭母牛繁殖性能良好；尼里與摩拉和德宏三元雜交水牛35頭（其中：♀31頭，♂4頭），由于年齡都在2～4歲之間，尚沒(méi)有繁殖性能的完整記錄。在采樣時(shí)，詳細(xì)記錄水牛的性別、毛色、年齡、外貌特征、父母及后代等特征特性，對(duì)于年齡在6歲以上，經(jīng)過(guò)多次配種而未受孕的母牛定義為存在繁殖障礙。對(duì)以上繁殖異常水牛進(jìn)行了外陰與生殖道直腸檢查，未發(fā)現(xiàn)性器官明顯異常。每頭水牛均由頸靜脈采集血液樣品，部分個(gè)體采集了耳組織樣品。

1.2 樣品采集

采血：用碘酒和酒精對(duì)牛頸靜脈處皮膚進(jìn)行消毒，用滅菌注射器或采血針采血1～2mL，置于肝素抗凝的采血管中，常溫下及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

耳組織取材：用手術(shù)刀片將牛耳皮上的毛發(fā)及附在其上的臟物刮除干凈，用酒精棉球仔細(xì)擦拭幾遍牛耳取材部位，用滅菌的小剪刀剪取一部分耳緣皮膚，將其迅速放入盛有培養(yǎng)基的小瓶子中常溫保存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、G－帶染色體及染色體核型分析

參照人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法［9］與 Seabright［10］的G－帶染色法并略作修改制備中期染色體及G－帶染色體標(biāo)本，對(duì)顯帶和分散較好的分裂相用CytoVision System （Applied Imaging）軟件進(jìn)行圖像拍攝和分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

尼里與摩拉和德宏三元雜水牛染色體分離比例采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 德宏水牛及雜交后代染色體核型分析

挑選形態(tài)清晰、顯帶和分散良好、收縮適中的染色體中期分裂相，進(jìn)行顯微拍照，并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。結(jié)果顯示，檢測(cè)的20頭德宏水牛的染色體數(shù)目均為2n＝48，染色體臂數(shù)為NF＝58，23對(duì)常染色體，其中1號(hào)染色體是一對(duì)大的中部著絲粒染色體，2號(hào)染色體為亞端著絲粒染色體，3號(hào)為亞中著絲粒染色體，4～5號(hào)是中著絲粒染色體，6～23號(hào)是端著絲粒染色體，1對(duì)性染色體中X染色體是最大的端著絲粒染色體，Y染色體是小型端著色粒染色體（圖1～A），與廣西本地水牛［11］及德昌水牛［12］的核型一致，符合沼澤型水牛的染色體數(shù)目與特征，為德宏水牛屬于沼澤型水牛類型提供了細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)。25頭摩拉與德宏二元雜水牛染色體數(shù)目均為2n＝49，47條常染色體，1對(duì)性染色體（圖1～B）。35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛出現(xiàn)2n＝49與2n＝50兩種染色體核型（圖1～C，D）。三元雜2n＝49核型特征與二元雜2n＝49水牛一致。而三元雜2n＝50水牛核型中，24對(duì)常染色體，1對(duì)性染色體，與1994年CSKBB［13］確定的河流型水牛的標(biāo)準(zhǔn)核型一致。

將德宏水牛染色體核型與二元雜和三元雜后代染色體核型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：德宏水牛2n＝48核型中少了一對(duì)三元雜2n＝50水牛核型中的9號(hào)端著絲粒染色體；德宏水牛1號(hào)染色體為一對(duì)大的中著絲粒染色體（圖1～A紅圈標(biāo)注），2n＝50水牛1號(hào)染色體為一對(duì)亞中著絲粒染色體；德宏水牛1號(hào)染色體的G－帶與2n＝50水牛4號(hào)和9號(hào)染色體相吻合（圖1～D紅圈標(biāo)注），染色體長(zhǎng)度近同，因此推測(cè)沼澤型水牛1號(hào)染色體可能是由河流型水牛4號(hào)和9號(hào)染色體發(fā)生端粒－著絲粒串聯(lián)融合形成的，這與Berardino等［5］報(bào)道的結(jié)果一致；2n＝49核型中的9號(hào)染色體不配對(duì)，4號(hào)染色體為兩條形態(tài)不同的染色體，一條為巨大4／9易位中著絲粒染色體，另一條為較小的原9號(hào)端著絲粒染色體（圖1～B，C紅圈標(biāo)注）。

2.2 水牛染色體核型與繁殖性能的關(guān)系

對(duì)采集的20頭德宏水牛和25頭摩拉與德宏二元雜水牛的繁殖記錄與染色體核型進(jìn)行分析，德宏水牛染色體數(shù)均為2n＝48，摩拉與德宏二元雜水牛均為2n＝49。雖然我們采集的德宏水牛和摩拉與德宏二元雜水牛均包括了配種及產(chǎn)仔數(shù)異常的母牛，但沒(méi)有檢測(cè)到染色體畸變現(xiàn)象，在有記錄的繁殖障礙與繁殖性能優(yōu)良的個(gè)體間也沒(méi)有檢測(cè)出染色體差異。而采集的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛年齡都在2～4歲之間，尚沒(méi)有繁殖性能的完整記錄，因此三元雜染色體多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

圖1 德宏水牛及雜交后代染色體核型

2.3 德宏水牛及雜交后代染色體多態(tài)性遺傳規(guī)律分析

德宏水牛染色體數(shù)為2n＝48，屬沼澤型水牛，其與河流型摩拉水牛雜交，雜交一代染色體數(shù)為2n＝49。隨著雜交代數(shù)的增加，雜交二代（三元雜）出現(xiàn)兩種染色體核型，分別為2n＝49，2n＝50；其中2n＝49核型占20頭，2n＝50類型占15頭，經(jīng)卡方檢測(cè)，χ2＝0.45714，χ2＜，P＞0.05，因此2n＝49和2n＝50兩種類型的核型分離比符合1∶1的關(guān)系。值得一提的是，無(wú)論2n＝49或2n＝50都呈現(xiàn)染色體平衡遺傳，即兩種類型染色體的DNA總量沒(méi)有出現(xiàn)明顯的重復(fù)和丟失，基因的總量基本相等。對(duì)摩拉與德宏水牛二元雜水牛2n＝49核型進(jìn)行分析，該核型中有3條不能配對(duì)的常染色體。黃右軍等［8］、梁夢(mèng)玫等［14］、馬彩霞等［15］對(duì)其減數(shù)分裂聯(lián)會(huì)復(fù)合體及其精子染色體進(jìn)行研究與分析發(fā)現(xiàn)，正是由于這3條不配對(duì)的常染色體，在減數(shù)分裂粗線期形成一條三價(jià)體聯(lián)會(huì)復(fù)合體，后期Ⅰ分離時(shí)，進(jìn)行平衡分離產(chǎn)生兩種正常配子，n＝24和n＝25，兩種配子的染色體數(shù)目雖然不同，但遺傳物質(zhì)總量是平衡一致的。當(dāng)2n＝49水牛與2n＝50河流型尼里水牛雜交時(shí)，導(dǎo)致其子代出現(xiàn)染色體多態(tài)性：2n＝50，2n＝49。進(jìn)行不平衡分離產(chǎn)生兩種異常配子，n＝24＋1和n＝25－1，異常配子與正常配子結(jié)合時(shí)，則導(dǎo)致非整倍性變異，同源染色體配對(duì)出現(xiàn)異常而致胚胎不能存活。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛染色體均由正常配子結(jié)合，未出現(xiàn)異常配子結(jié)合類型。

3 結(jié)論與討論

家養(yǎng)水牛分為河流型與沼澤型水牛，河流型水牛染色體數(shù)為2n＝50，沼澤型水牛染色體數(shù)為2n＝48。與馬和驢、黃牛與牦牛及雞與鵪鶉等不同染色體數(shù)目的物種之間雜交后代不育或單性不育不同，河流型與沼澤型水牛雜交后代雙性均可育，并且出現(xiàn)染色體多態(tài)類型［5，7］。仔細(xì)查看河流型與沼澤型水牛染色核型及染色體多態(tài)性特征，可發(fā)現(xiàn)它們的染色體差異涉及兩對(duì)非同源染色體，即河流型水牛4號(hào)和9號(hào)染色體易位形成沼澤型水牛1號(hào)染色體。染色體易位包括單向易位、羅伯遜易位及串聯(lián)易位，從圖1可看出，沼澤型水牛1號(hào)染色體是由河流型水牛4號(hào)和9號(hào)染色體串聯(lián)易位而成，并且是由9號(hào)端著絲粒染色體與4號(hào)亞中著絲粒染色體的短臂（p臂）發(fā)生串聯(lián)融合。與其他易位類型不同，串聯(lián)易位形成的新染色體與原染色體在染色體長(zhǎng)度、DNA含量之間差異較小，這可能就是河流型與沼澤型水牛雜交后代可育并出現(xiàn)染色體多態(tài)性的主要原因。具體這種串聯(lián)易位的起源與進(jìn)化機(jī)制以及串聯(lián)融合所帶來(lái)的遺傳效應(yīng)與表型效應(yīng)尚待進(jìn)一步研究。

雖然我們?cè)跇悠凡杉c染色體分析過(guò)程中，有意識(shí)的選擇了有明顯繁殖障礙的德宏水牛及摩拉與德宏雜交水牛，期望找到與繁殖障礙有關(guān)的染色體變異，然而德宏水牛及二元雜后代不同繁殖性能個(gè)體間無(wú)論在染色體核型、G帶帶型還是染色體數(shù)目方面均無(wú)顯著差異。黃右軍等［6］比較了三元雜水牛2n＝49與2n＝50出產(chǎn)月齡、妊娠期、產(chǎn)后第一次發(fā)情、產(chǎn)仔間隔、情期受胎率及年受胎率等繁殖性能，發(fā)現(xiàn)2n＝49個(gè)體比2n＝50個(gè)體情期配種受胎率降低12.3%，年受胎率降低6.4%。由于本實(shí)驗(yàn)采集的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛年齡都在2～4歲之間，尚沒(méi)有繁殖性能的完整記錄，因此德宏水牛三元雜后代染色體多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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