鄭金珠，劉翻，孫元社，唐濤，張維冰，李彤

（1.齊齊哈爾大學(xué)， 黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2.上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)， 上海 200237； 3.大連依利特分析儀器有限公司， 遼寧 大連 116023；4.遼寧大連依利特分析儀器工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116023）

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，啤酒已經(jīng)成為餐桌上不可缺少的一部分，其中的胺類(lèi)物質(zhì)與其質(zhì)量密切相關(guān)[1]，故啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量對(duì)于區(qū)分不同種類(lèi)不同品牌的啤酒以及辨別假冒偽劣產(chǎn)品具有重要的參考價(jià)值。啤酒中還可能有含強(qiáng)致癌性的亞硝胺類(lèi)化合物[2,3]，控制其在啤酒中的含量對(duì)人們的身體健康具有重要意義。

胺類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法包括薄層色譜法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳、電化學(xué)法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[4,5]，卓平等人[6]采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中10種生物胺，檢測(cè)限為μg/g。但啤酒中許多胺類(lèi)物質(zhì)含量極低，常規(guī)方法很難進(jìn)行直接分離和檢測(cè)，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIFD)作為目前靈敏度最高的檢測(cè)技術(shù)之一[7]，在痕量物質(zhì)檢測(cè)方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[8]，劉春鳳等人[9]采用FITC衍生激光誘導(dǎo)熒光法與毛細(xì)管電泳偶聯(lián)法檢測(cè)啤酒中的14種生物胺，結(jié)果顯示不同種類(lèi)的啤酒中生物胺的種類(lèi)和含量均不相同。

本文以FITC為衍生試劑，對(duì)啤酒進(jìn)行衍生，以HPLC-LIFD系統(tǒng)對(duì)啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，同時(shí)采用真空低溫蒸餾結(jié)合GC-FID法對(duì)啤酒中4種不能用FITC衍生的揮發(fā)性的亞硝胺類(lèi)化合物進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)展了啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)的高靈敏度和高選擇性的分析方法，并使用該方法考察了市場(chǎng)上多種啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（大連依利特分析儀器有限公司）；GC7890Ⅱ氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測(cè)器（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC )(98%，Sigma)；N-亞硝基二乙胺（NDEA，98.5%）、N-亞硝基二丁胺（NDBA，98.5%）、N-亞硝基哌啶( NPIP，99%)和N-亞硝胺吡咯烷(NPYR，98.5%)均購(gòu)自Fluka公司；實(shí)驗(yàn)用水均為milli-Q過(guò)濾超純水；啤酒樣品均于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 樣品前處理

1.2.1 衍生過(guò)程（HPLC-LIFD法）

量取5μmoL/L的FITC 60μL,加入340μL 50mmol/L磷酸鈉緩沖溶劑（pH=11），然后與100μL啤酒樣品混合均勻，避光衍生6h后加入500μL水，直接進(jìn)樣分析。

1.2.2 真空低溫蒸餾(GC-FID法）

參照GB/T 5009.26-2003[10]中真空低溫蒸餾法，同時(shí)加大前處理量后對(duì)啤酒中亞硝胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取和富集：量取150mL啤酒，超聲脫氣后加入8mL氫氧化鈉溶液（1mol/L），在真空度約為53KPa下蒸餾至約10mL，再將真空度調(diào)至約95KPa，直至近干。然后往餾出液中加入8mL鹽酸（0.1mol/L）并混勻，用40mL二氯甲烷萃取三次，合并120mL萃取液用無(wú)水硫酸鈉除水后移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在（37±2）℃水浴下旋蒸濃縮至約5mL，再氮吹定容至0.5mL備用。

1.3 色譜條件

1.3.1 HPLC-LIFD

色譜柱：ODS2 5μm(4.6mm×150mm)；流動(dòng)相：A10mmoL/L乙酸銨（pH=8.0～8.5），B乙腈，梯度洗脫程序：0～10min，6%～15%B；15～25min，15%～17% B；15～25min，17%～40%B；進(jìn)樣量20μL，室溫下分析。

1.3.2 GC-FID

采用TM-1毛細(xì)管色譜柱（0.53 mm×30m×0.1μ m），初溫60℃，保持3min，10℃/min升至280℃保持5min；進(jìn)樣口溫度250℃； 檢測(cè)器溫度250℃；載氣：氮?dú)?，流?mL/min；進(jìn)樣量1μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-LIFD分析

2.1.1 方法建立

FITC衍生胺類(lèi)物質(zhì)時(shí)，一般需12h以上[11]，而Ming Du等人[12]研究發(fā)現(xiàn)FITC衍生生物胺時(shí)6h即達(dá)到平衡。以某品牌啤酒A為樣品，考察了FITC衍生時(shí)間分別為6、12、24、36、60h樣品在選定色譜條件下出峰情況。結(jié)果顯示衍生6h色譜峰峰數(shù)最多，而峰高變化無(wú)規(guī)律。綜合考慮出峰數(shù)量與峰高，選擇衍生時(shí)間為6h。

為得到更多樣品信息，各色譜峰盡量在整個(gè)色譜圖中分布均勻，對(duì)梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下以啤酒A為樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，考察方法穩(wěn)定性，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.2 實(shí)際啤酒樣品分析

市購(gòu)11種不同品牌和同一品牌不同系列的啤酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，用FITC按照1.2.1方法進(jìn)行衍生后，按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和相對(duì)含量進(jìn)行考察，以峰高值1mV為積分閾值，計(jì)算樣品色譜圖中色譜峰數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，11種啤酒樣品色譜峰在色譜圖中的分布具有一定趨勢(shì)：在5min～10min和15～23min大部分胺類(lèi)物質(zhì)的含量較低，10min～15min之間含量較高。同時(shí)不同啤酒樣品色譜圖中色譜峰數(shù)和峰高值差異較大。

圖1為某品牌啤酒B的四個(gè)系列分析色譜圖，從圖中可以看出，樣品B1-B4出峰數(shù)量和峰高均有一定差異。四種系列啤酒的出峰數(shù)分別為44、42、40和47。樣品B1的1號(hào)色譜峰和2號(hào)色譜峰高值遠(yuǎn)高于其它三種，而在10min～15min樣品B2色譜峰峰高值高于其它兩種。

圖1 某品牌啤酒樣品B 4種系列檢測(cè)色譜圖（色譜條件見(jiàn)1.3.1）

圖2為4種不同品牌啤酒C-F，色譜峰數(shù)分別為51、38、38和48，樣品D的1號(hào)峰高值高于其它三種。而在10～20min之間，樣品C的峰高值高于其它三種。

圖2 4種不同品牌啤酒檢測(cè)結(jié)果（色譜條件見(jiàn)1.3.1）

圖3 3種不同品牌啤酒檢測(cè)結(jié)果（色譜條件見(jiàn)1.3.1）

圖3為3種不同品牌啤酒樣品G-I，色譜峰峰數(shù)分別為40、49和53，其中樣品I的1號(hào)峰和2號(hào)峰峰高值遠(yuǎn)低于其它兩種，而在10～15min之間樣品H色譜峰峰高值遠(yuǎn)高于其它兩種。

2.2 GC-FID分析N-亞硝基類(lèi)化合物

2.2.1 方法建立

N-亞硝基類(lèi)化合物具有強(qiáng)致癌性，不能用FITC衍生[13]，其分析一般使用靈敏度較高的熱能分析儀、質(zhì)譜或氮磷檢測(cè)器[14-16]。本文采用靈敏度較低但使用更普遍的FID檢測(cè)器。

在1.3.2色譜條件下，NDEA、NDBA、NPIP和NPYR4種化合物在14min內(nèi)全部出峰，且與雜質(zhì)達(dá)到基線(xiàn)分離。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該方法進(jìn)行了論證。結(jié)果表明4種化合物在0.005-0.1mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，方法檢出限達(dá)到μg/L。且方法穩(wěn)定，加標(biāo)濃度為0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL時(shí)，4種物質(zhì)回收率均在70～90%之間；加標(biāo)濃度為0.08mg/mL時(shí)，平行5次實(shí)驗(yàn)，NDEA、NDBA、NPIP、NPYR回收率RSD值分別為3.50%、2.27%、5.72%和7.56%。

2.2.2 實(shí)際樣品分析

以上述方法對(duì)超市購(gòu)買(mǎi)3種不同品牌啤酒樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4），3種啤酒中NPIP和NPYR均未檢出，樣品K中NDEA及NDBA的含量分別為20.00μg/L和29.55μg/L，樣品J含有22.01μg/L的NDEA。

圖3 3啤酒樣品中4種亞硝胺測(cè)定結(jié)果（色譜條件見(jiàn)1.3.2）

3 結(jié) 論

使用HPLC-LIFD與GC-FID結(jié)合，發(fā)展了一種啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。以FITC為衍生試劑，對(duì)啤酒中含有-NH2和-NH-基團(tuán)的胺類(lèi)物質(zhì)直接進(jìn)行衍生，HPLC-LIFD分析，對(duì)市場(chǎng)上11種啤酒進(jìn)行了分析。結(jié)果表明不同品牌啤酒中胺類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)、數(shù)量及含量均存在一定差異，以峰高值1mV為積分閾值，出峰數(shù)從38至53之間不等。同時(shí)使用真空蒸餾GC-FID法對(duì)啤酒中4種具有特殊結(jié)構(gòu)的亞硝胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了分析，綜合評(píng)價(jià)啤酒總胺類(lèi)物質(zhì)的組成，在分析的3種啤酒其中兩種中檢測(cè)到微量亞硝胺類(lèi)物質(zhì)。該方法靈敏度高，穩(wěn)定性高，適用于啤酒及其它食品中胺類(lèi)物質(zhì)的分析，特別是痕量胺類(lèi)物質(zhì)的分析。對(duì)于食品中胺類(lèi)物質(zhì)的研究、假冒偽劣產(chǎn)品的辨別和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控具有重要的參考價(jià)值。

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