辣椒素誘導(dǎo)HSP27高表達(dá)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡機(jī)制

黃崇杰，姜愛琴，劉長寶

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有明顯上升趨勢[1]。治療以外科手術(shù)為主，但對中晚期的患者，化療成為必須的輔助治療?；煂Υ竽c癌的療效不一，且毒副作用較大。近年來，有關(guān)辣椒素抗癌作用的研究在國內(nèi)外日益受到重視，已有體外研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素能明顯抑制人胰腺癌、肝癌細(xì)胞生長[2-3]，辣椒素對腸癌細(xì)胞的作用效果及機(jī)制尚未闡明。本研究以HSP27 高表達(dá)的人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞為研究對象，觀察辣椒素對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 購自中科院上海分院；辣椒素購自美國Sigma 公司；RP-MI1640 培養(yǎng)基、0.05%的胰酶、購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma 公司；CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒購自Fermanats 公司；β-actin 鼠抗人抗體、兔抗人HSP-27、兔抗人Active-caspase3 抗體、兔抗人Active-caspase9抗體購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG 購自美國Santa Cruz 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自美國Pierce 公司、顯影定影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至約70%～90%的融合狀態(tài)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制 將12.2 mg 的辣椒素粉劑溶于100 μL 的DMSO 溶劑(二甲基亞砜)，配制成4×105μmol/L的母液，-20 ℃冰箱保存，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋母液，配制成終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L 的辣椒素用于實(shí)驗(yàn)(各組含藥培養(yǎng)基中DMSO終體積分?jǐn)?shù)均小于0.1%)。

1.2.3 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分為空白調(diào)零對照組(不含細(xì)胞)、正常對照組、溶劑對照組(含終體積分?jǐn)?shù)為0.1%DMSO)和終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的辣椒素組，細(xì)胞經(jīng)24 h貼壁，更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞同步化，再更換成上述含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h、36 h、48 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，培養(yǎng)作用1 h 后用酶標(biāo)儀于450 nm波長測吸光度值(A值)。取8 孔平均值，計(jì)算抑制率。細(xì)胞抑制率IR(100%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A 值)/(正常對照組A 值-空白對照組A值)]×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 將細(xì)胞分為正常對照組、溶劑對照組(0.1%DMSO)和終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的辣椒素組，經(jīng)藥物處理24 h后，將懸浮細(xì)胞以及用胰酶消化下來的貼壁細(xì)胞收集在一起，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清液用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞。按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書，對細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidiumiodide, PI)染色。避光10 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)，Annexin V 單陽性為早期凋亡細(xì)胞，分析軟件CellQuest計(jì)算細(xì)胞早期凋亡率。

1.2.5 RT-PCR 檢 測 細(xì) 胞HSP27、casepase-3、casepase-9 mRNA 的表達(dá) 收集20 cm2培養(yǎng)皿內(nèi)經(jīng)300 μmol/L辣椒素處理0 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的細(xì)胞，Trizol 提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA 濃度，按照Fermanats 試劑盒產(chǎn)品說明書操作合成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(見表1)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳觀察。凝膠影像分析系統(tǒng)掃描照片，條帶用Gelprol32軟件分析，以目的片段與內(nèi)參擴(kuò)增片段條帶的光密度積分值的比值來評定各mRNA的表達(dá)水平。

表1 PCR熱循環(huán)反應(yīng)體系（預(yù)變性均為94 ℃，5 min ；延伸均為72 ℃，1 min 最后一循環(huán)72 ℃，5 min）

1.2.6 Western blot 檢 測 HSP27、casepase-3、casepase-9 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)300 μmol/L 辣椒素作用0 h、24 h、36 h和48 h后用胰酶消化收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS 漂冼2 次。用含1%PMSF 的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA 分析試劑測定樣品總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性10 min。每組各取100 μg總蛋白樣品，以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。兔抗人HSP27抗體和兔抗人casepase-3、casepase-9抗體(1∶500)4 C°孵育過夜，TBST洗膜15 min×2 次后加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG(1∶500)，常溫孵育2 h，TBST 洗膜15 min×2 次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光顯影。β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One 凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 軟件包，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組資料比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株的生長抑制作用 采用CCK-8 法檢測SW480 細(xì)胞增值，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，0.1%DMSO 組作用24 h、36 h、48 h 均無統(tǒng)計(jì)意義(P ＞0.05)，表明0.1%體積分?jǐn)?shù)的DMSO 對細(xì)胞無明顯毒性作用；與正常對照組及0.1%DMSO 組比較，100 μmol/L 辣椒素組作用24 h、36 h 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，作用48 h 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表2)。余各濃度各時(shí)間點(diǎn)辣椒素作用于細(xì)胞后，其生長抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同濃度辣椒素對SW480細(xì)胞的生長抑制作用(x±s,%)

2.2 辣椒素對SW480 細(xì)胞早期凋亡的影響 用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，不同濃度辣椒素及0.1%DMSO作用于SW480細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測分析。結(jié)果顯示，0.1%DMSO 組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)；辣椒素能誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞早期凋亡，其早期凋亡率在100～300 μmol/L濃度時(shí)逐漸升高。而400 μmol/L時(shí)卻較300 μmol/L 低，與正常對照組及0.1%DMSO 組比較，除100 μmol/L 辣椒素組外，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05, P ＜0.01)。300 μmol/L 辣椒素組與200 μmol/L、400 μmol/L辣椒素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1。

2.3 辣 椒 素 對SW480 細(xì) 胞HSP27、casepase-3 及casepase-9 mRNA 表達(dá)的影響 與正常組相比，300 μmol/L濃度辣椒素作用細(xì)胞后HSP27 mRNA表達(dá)水平隨辣椒素作用時(shí)間延長而下調(diào)，casepase-3及casepase-9 mRNA 表達(dá)則呈作用時(shí)間依賴性上調(diào)，其中36、48 h 組差異顯著(P ＜0.01)。見圖2，表3。

圖1 不同濃度辣椒素對SW480細(xì)胞早期凋亡的影響

圖2 辣椒素對SW480細(xì)胞HSP27、caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

表3 辣椒素對SW480細(xì)胞HSP27、caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)的影響(x±s，n=6)

2.4 辣 椒 素 對SW480 細(xì) 胞HSP27、casepase-3 及casepase-9 蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，300 μmol/L 濃度辣椒素作用細(xì)胞后，HSP27 蛋白表達(dá)水平隨辣椒素作用時(shí)間延長而下調(diào)，活化casepase-3 及casepase-9 的表達(dá)則呈作用時(shí)間依賴性上調(diào)，其中36 h、48 h 組差異顯著(P ＜0.01)。見圖3，表4。

圖3 辣椒素對SW480細(xì)胞HSP27、caspase-3、caspase-9 蛋白表達(dá)的影響

表4 辣椒素對SW480細(xì)胞HSP27、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)的影響(x±s，n=3)

3 討論

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是大多數(shù)化療藥物作用的主要機(jī)制[4-5]，但多藥耐藥及嚴(yán)重的化療副作用是化療失敗或停止化療的主要原因。從天然植物中尋找高療效、低不良反應(yīng)及改善生存質(zhì)量的藥物，已成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一。辣椒素又稱辣椒堿，是紅辣椒中的一種活性成分，其結(jié)構(gòu)為反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺。近年來，國外相繼有文獻(xiàn)報(bào)道了辣椒素在腫瘤防治方面的作用，引起了廣泛重視。Wu 等[6]通過對食管表皮樣癌CE81T／VGH 細(xì)胞株體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)辣椒素通過抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶CDKII和細(xì)胞周期素(cyclin)E復(fù)合體的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。Mori等[7]報(bào)道，辣椒素可以抑制人前列腺癌裸鼠模型新生腫瘤的形成?，F(xiàn)在相繼有報(bào)道顯示，辣椒素可以引起多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，包括胰腺癌、肝癌、乳腺和前列腺癌等[1-2,8-9]。但辣椒素引起腫瘤細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制仍然不明確?，F(xiàn)有的國內(nèi)外文獻(xiàn)重點(diǎn)研究了辣椒素對凋亡正向調(diào)控蛋白和周期阻滯的影響。為了證實(shí)辣椒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用并探討其其它的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了辣椒素對凋亡負(fù)調(diào)控蛋白HSP27 的作用以及對caspase凋亡信號通路的影響，以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞為研究對象，通過CCK-8 檢測，結(jié)果表明，辣椒素對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率呈明顯的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。不同濃度辣椒素作用于細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，藥物溶劑0.1%DMSO 組和低濃度劑量辣椒素(100 μmol/L)對細(xì)胞的作用不明顯，早期凋亡率與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。而中高濃度劑量的辣椒素，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著劑量的升高，表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。其中300 μmol/L 濃度組的早期凋亡率最高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。所以，做為最佳誘導(dǎo)劑量，用于后續(xù)的相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的檢測。

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)又稱應(yīng)激蛋白，是指細(xì)胞在應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一組序列高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核生物中，應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)。大量研究表明，其在腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織明顯增高。最近的蛋白組學(xué)研究表明，HSP27在結(jié)直腸癌中的過表達(dá)，與化療耐藥和預(yù)后不良存在必然聯(lián)系[10]。Tsuruta等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌細(xì)胞HSP27 的表達(dá)與5-FU 耐藥成正相關(guān)，下調(diào)HSP27 的表達(dá)可以增加5-FU 的敏感性，細(xì)胞內(nèi)HSP27 表達(dá)增高與大腸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能是大腸癌發(fā)展、惡化的重要標(biāo)志。HSP27 對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，目前普遍認(rèn)為是通過它的抗凋亡作用來實(shí)現(xiàn)的[12-13]。Concannon 等[14]通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，HSP27 與細(xì)胞色素C 和caspase-3 酶原相螯合，阻止了凋亡小體復(fù)合物的正確形成以及其功能的執(zhí)行。實(shí)際上，HSP27 結(jié)合于從線粒體釋放入胞質(zhì)的細(xì)胞色素C，阻止了細(xì)胞色素C-介導(dǎo)的Apaf-1與caspase-9酶原的互作，從而特異的干擾了caspase依賴型細(xì)胞凋亡的線粒體通路。Rocchi等[15]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞中，HSP27 表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致caspase-3 活性的增加，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的生長，驗(yàn)證了HSP27 能夠調(diào)節(jié)caspase-3 的活性。而有文獻(xiàn)報(bào)道，辣椒素能通過caspase蛋白酶依賴途徑來誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了辣椒素對HSP27、caspase3、caspase9 的作用，初步探討其可能存在的相關(guān)性，通過RT-PCR 和Western blot檢測了辣椒素對SW480細(xì)胞Hsp27、casepase-3、casepase-9 mRNA 及蛋白水平表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)辣椒素可下調(diào)HSP27 蛋白的表達(dá)、同時(shí)伴隨casepase-3、casepase-9 蛋白表達(dá)增高，作用36 h、48 h 時(shí)較為明顯，與正常組相比，差異顯著(P ＜0.01)。表明辣椒素可能通過抑制HSP27 的表達(dá)而直接誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，或通過下調(diào)HSP27 的表達(dá)，從而增加caspase-3、caspase-9 的活性，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但辣椒素作用于HSP27 的具體機(jī)制，以及對caspase-3、caspase-9上游通路的作用，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了辣椒素的體外抗癌作用，表明辣椒素能明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)凋亡，調(diào)節(jié)HSP27、casepase-3、casepase-9蛋白的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

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