王康，張正陽，宋廉，龔愛華，王冬青，朱海濤

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

肝癌全球死亡率居腫瘤性疾病第2位，現(xiàn)有的治療方案包括手術(shù)和非手術(shù)療法，效果有限［1］。鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非凋亡、非壞死性細(xì)胞死亡方式，其所依賴的殺死腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路與經(jīng)典的凋亡、壞死途徑完全不同［2-3］。因此，有望用誘導(dǎo)鐵死亡的手段來殺死一些耐凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞，比如肝癌細(xì)胞。青蒿琥酯是青蒿素衍生物的一種，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的過量聚集來殺死多種腫瘤細(xì)胞［4-5］。研究表明［6-8］，青蒿素及其衍生物引起的細(xì)胞死亡為非凋亡非壞死性模式；同時(shí)有研究表明，青蒿琥酯可以引起胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡［9］，但其能否在其他組織來源的腫瘤細(xì)胞如肝癌細(xì)胞中引起鐵死亡目前仍不清楚。熱休克蛋白5（heat shock protein family A member 5，HSPA5）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，同時(shí)也是一種分子伴侶，當(dāng)細(xì)胞受到各種有害刺激時(shí)，可以保護(hù)細(xì)胞避免死亡［10］。HSPA5表達(dá)與肝癌對(duì)鐵死亡的誘導(dǎo)劑Erastin、柳氮磺嘧啶的耐藥性相關(guān)［6，11］，但 HSPA5是否與癌癥細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯耐藥性相關(guān)仍不明確。本研究擬探討青蒿琥酯能否引起肝癌細(xì)胞的鐵死亡及HSPA5對(duì)青蒿琥酯誘導(dǎo)下的肝癌化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；青蒿琥酯、鐵死亡抑制劑ferrostatin-1、凋亡抑制劑 ZVAD-FMK、壞死抑制劑 necrosulfonamide（美國(guó)MedChemExpress公司）；兔抗人多克隆抗體HSPA5，小鼠抗人多克隆抗體GAPDH，丙二醛檢測(cè)試劑盒均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；6孔板、96孔板（美國(guó)Corning公司）；CCK-8試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）；蛋白質(zhì)印跡法全自動(dòng)凝膠成像儀（中國(guó)Sage Creation公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BectonDickin-son公司）；HSPA5過表達(dá)和干擾慢病毒套裝（蘇州復(fù)百澳生物科技有限公司，病毒滴度約為1×109IU/mL，載體為FV055）；C11-BODIPY熒光染料（美國(guó)Thermo公司）。進(jìn)行以下分組：對(duì)照組、青蒿琥酯組、青蒿琥酯+ferrostatin-1組、青蒿琥酯+ZVAD-FMK組、青蒿琥酯+necrosulfonamide組，分別與二甲基亞砜、20μmol/L青蒿琥酯、20μmol/L青蒿琥酯+1μmol/L ferrostatin-1、20μmol/L青蒿琥酯+1μmol/L ZVAD-FMK、20 μmol/L青蒿琥酯+0.5μmol/L necrosulfonamide共培養(yǎng)24 h。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

1.2.2.1 選取青蒿琥酯最佳濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，接種于96孔板，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；次日細(xì)胞貼壁后，每孔加入100μL反應(yīng)溶液（90μL無血清培養(yǎng)基+10μL CCK-8試劑），同時(shí)設(shè)立空白組（只含DMEM）進(jìn)行校正，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔光密度（D）值。

1.2.2.2 檢測(cè)不同細(xì)胞死亡方式抑制劑對(duì)青蒿琥酯殺傷SMMC-7721細(xì)胞的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，接種于96孔板，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；次日細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行以下分組：對(duì)照組、青蒿琥酯組、青蒿琥酯+ferrostatin-1組、青蒿琥酯+ZVAD-FMK組、青蒿琥酯+necrosulfonamide組，分別與二甲基亞砜、20μmol/L青蒿琥酯、20μmol/L青蒿琥酯+1μmol/L ferrostatin-1、20 μmol/L青蒿琥酯+1μmol/L ZVAD-FMK、20μmol/L青蒿琥酯+0.5μmol/L necrosulfonamide共培養(yǎng)24 h；CCK-8法測(cè)各組細(xì)胞活性（具體實(shí)驗(yàn)操作方法同“1.2.2.1”）。

1.2.3 細(xì)胞分組及相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)期SMMC-7721細(xì)胞，加入胰酶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化5 min；用含血清培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液，接種入2塊6孔板，每孔培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，將細(xì)胞分為二甲基亞砜組、青蒿琥酯組、青蒿琥酯+去鐵胺組，分別用二甲基亞砜、20μmol/L青蒿琥酯、20μmol/L青蒿琥酯+100 mmol/L去鐵胺處理24 h。

1.2.3.2 脂質(zhì)來源活性氧水平檢測(cè) 棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍；每孔加入0.5 mL 0.25%胰酶（不含EDTA）消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打均勻；將細(xì)胞懸液以1 200 r/min，4℃離心5 min；棄上清液，用無血清培養(yǎng)基重懸。每1 mL細(xì)胞懸液中加入10 mmol/L C11-BODIPY（581/591）儲(chǔ)存液，使其終濃度為10μmol/L，輕輕吹打均勻后放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min；每隔5 min輕輕搖晃，以使細(xì)胞與C11-BODIPY（581/591）充分混勻；用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以去除背景干擾。收集各組細(xì)胞懸液至流式管，室溫避光孵育5 min以去除死細(xì)胞干擾。流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)581 nm、發(fā)射波長(zhǎng)591 nm）各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.3.3 丙二醛含量檢測(cè) 棄舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍；每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞；將裂解后的樣品轉(zhuǎn)移至EP管，1 200 r/min，4℃離心5 min；取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度；按照產(chǎn)品說明書推薦比例配置丙二醛檢測(cè)工作液。將0.1mL樣品和0.2mL檢測(cè)工作液旋渦混勻器混勻；100℃加熱60min，冷卻至室溫；4℃1 200 r/min離心15 min，冷卻至室溫；取200μL上清液于96孔板中測(cè)定535 nm處各孔光密度值。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞中丙二醛含量：丙二醛濃度（μmol/mg）=（D測(cè)定-D空白）/（D標(biāo)準(zhǔn)-D空白）×10/蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.2.4 HSPA5低表達(dá)和過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 取對(duì)數(shù)期SMMC-7721細(xì)胞均勻接種至6孔板，每孔約5×105，接種3孔；用10%含血清DMEM于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞融合率達(dá)到70%左右時(shí)，分為3組：對(duì)照組、HSPA5-shRNA組、Flag-HSPA5組，分別每孔加入50μL空載（Vector）、HSPA5-shRNA、Flag-HSPA5病毒液；混勻后在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h；更換為10%含血清的常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4.1 qRT-PCR檢測(cè)HSPA5 mRNA表達(dá)水平

棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍；用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參，定量檢測(cè)擴(kuò)增HSPA5的mRNA水平。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBRGreen 5μL、雙蒸水4μL、上下游引物各0.25μL、cDNA 0.5μL，總反應(yīng)體系為10μL。按如下條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s；60℃退火 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用 2-△△CT表示目的mRNA的表達(dá)水平。HSPA5引物序列：上游5′-CTGTCCAGGCTGGTGTGCTCT-3′；下游5′-CTTGGTAGGCACCACTGTGTTC-3′。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HSPA5蛋白的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，抽提總蛋白，裂解細(xì)胞時(shí)加入2×蛋白上樣緩沖液，100℃ 煮沸5 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；取上清液，100 V行10%SDSPAGE分離蛋白；用半干電轉(zhuǎn)化法300 mA轉(zhuǎn)至PVDF膜（需提前在甲醇中浸泡3 min），轉(zhuǎn)膜2 h；5%BSA室溫封閉1 h；加入兔抗HSPA5抗體，小鼠抗GAPDH抗體（內(nèi)參，稀釋比為1∶1 000，TBST為抗體稀釋液），4℃孵育過夜；次日用1×TBST洗滌3次，每次10 min；分別加入相應(yīng)的兔、鼠二抗（稀釋比為1∶5 000）室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光試劑顯影。采用Image J軟件處圖像。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空載、過表達(dá)及干擾HSPA5的SMMC-7721細(xì)胞，加入胰酶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化5 min；用含血清培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板（用于CCK-8檢測(cè)）或6孔板（用于丙二醛含量檢測(cè)），每孔4 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每種細(xì)胞共種6個(gè)孔；次日細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行以下分組：二甲基亞砜+空載質(zhì)粒組、二甲基亞砜+HSPA5-shRNA干擾質(zhì)粒組、二甲基亞砜+Flag-HSPA5過表達(dá)質(zhì)粒組、青蒿琥酯+空載質(zhì)粒組、青蒿琥酯+HSPA5-shRNA干擾質(zhì)粒組、青蒿琥酯+Flag-HSAPA5過表達(dá)質(zhì)粒組；其中，二甲基亞砜+空載質(zhì)粒組、二甲基亞砜+HSPA5-shRNA干擾質(zhì)粒組、二甲基亞砜+Flag-HSPA5過表達(dá)質(zhì)粒組與二甲基亞砜共培養(yǎng)24 h，青蒿琥酯+空載質(zhì)粒組、青蒿琥酯共培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 具體實(shí)驗(yàn)操作方法同“1.2.2.1”。

1.2.5.3 丙二醛含量檢測(cè) 具體實(shí)驗(yàn)操作方法同“1.2.3.2”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯最佳作用條件

與0μmol/L相比，20、40μmol/L青蒿琥酯處理組細(xì)胞存活率明顯降低（t=6.587，16.400，P均＜0.05）；其中20μmol/L青蒿琥酯處理SMMC-7721細(xì)胞時(shí)，藥物濃度達(dá)到半數(shù)致死量。故選20μmol/L青蒿琥酯作為最佳實(shí)驗(yàn)濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2 青蒿琥酯促進(jìn)肝癌細(xì)胞鐵死亡

由圖2可見，青蒿琥酯組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組（t=5.743，P＜0.05），青蒿琥酯+ferrostatin-1組細(xì)胞活性明顯高于青蒿琥酯組（t=2.857，P＜0.05），青蒿琥酯+ZVAD-FMK組和青蒿琥酯+necrosulfonamide組細(xì)胞活性與青蒿琥酯組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此說明，鐵死亡抑制劑可抑制青蒿琥酯的細(xì)胞毒作用，而凋亡或壞死抑制劑對(duì)青蒿琥酯的細(xì)胞毒作用抑制不明顯。

圖2 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率

2.3 青蒿琥酯促進(jìn)肝癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)

與對(duì)照組相比，青蒿琥酯處理的SMMC-7721細(xì)胞脂質(zhì)來源活性氧水平和丙二醛水平明顯增高（t=7.247，3.236，P均＜0.05）。與青蒿琥酯組相比，青蒿琥酯+去鐵胺組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)來源活性氧和丙二醛水平明顯降低（t=4.900，3.472，P均＜0.05）。見圖3～4。由此表明，青蒿琥酯引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化。同時(shí)，這種過氧化可被鐵離子螯合劑去鐵胺所抑制。

2.4 病毒感染SMMC-7721細(xì)胞后HSPA5 mRNA和蛋白的表達(dá)

與Vector組相比，HSPA5-shRNA組HSPA5 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（t分別為12.480，8.141，P均＜0.05），而 Flag-HSPA5組 HSPA5 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（t分別為18.280，8.632，P均＜0.05）。見圖5～6。由此表明，SMMC-7721細(xì)胞中HSPA5質(zhì)粒干擾及過表達(dá)效率較高。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)來源活性氧水平比較

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)丙二醛水平比較

圖5 qRT-PCR法檢測(cè)HSPA5 mRNA的表達(dá)

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)感染病毒后HSPA5蛋白的表達(dá)

2.5 干擾HSPA5促進(jìn)青蒿琥酯殺傷效力

由圖7可見，青蒿琥酯組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組（t=17.09，P＜0.05），青蒿琥酯+HSPA5-shRNA組細(xì)胞活性明顯低于青蒿琥酯組（t=2.841，P＜0.05），而青蒿琥酯+Flag-HSPA5組細(xì)胞活性明顯高于青蒿琥酯組（t=8.491，P＜0.05）。青蒿琥酯組細(xì)胞丙二醛水平明顯高于對(duì)照組（t=2.796，P＜0.05），青蒿琥酯+HSPA5-shRNA組細(xì)胞丙二醛水平明顯高于青蒿琥酯組（t=6.720，P＜0.05），而青蒿琥酯+Flag-HSPA5組細(xì)胞丙二醛水平明顯低于青蒿琥酯組（t=14.23，P＜0.05）。見圖8。

圖7 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性

圖8 細(xì)胞內(nèi)丙二醛水平

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中，鐵死亡特異性抑制劑ferrostatin-1可消除青蒿琥酯對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，而凋亡抑制劑ZVAD-FMK或壞死抑制劑necrosulfonamide則起不到顯著的殺傷抑制作用；此外在青蒿琥酯的作用下，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平增高，而鐵離子螯合劑去鐵胺可以消除青蒿琥酯所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子過載相關(guān)。有研究表明，青蒿琥酯可以在人胰腺癌細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞中引起鐵死亡［5，12］。這與我們對(duì)青蒿琥酯可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的猜想相一致。但同時(shí)也有研究顯示，青蒿琥酯可以引起乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［13］。這可能是由于不同組織來源的細(xì)胞對(duì)鐵死亡或者凋亡的敏感性不同所導(dǎo)致。

同凋亡壞死一樣，在青蒿琥酯誘導(dǎo)的鐵死亡中一些基因如HSPA5，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯產(chǎn)生耐藥性［14］。HSPA5表達(dá)與肝癌對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin、柳氮磺嘧啶的耐藥性相關(guān)［6，11］，但 HSPA5是否與癌癥細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯耐藥性相關(guān)仍不明確。本研究用干擾質(zhì)粒HSPA5-shRNA抑制HSPA5表達(dá)后，肝癌細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的化療抵抗能力明顯下降；在同樣濃度的青蒿琥酯處理下，干擾 HSPA5的SMMC-7721細(xì)胞活性明顯低于未干擾組，而脂質(zhì)過氧化水平則高于未干擾組；由此表明，通過抑制腫瘤細(xì)胞中HSPA5蛋白表達(dá)可能增強(qiáng)青蒿琥酯化療效果，但HSPA5具體通過何種信號(hào)通路和機(jī)制來影響青蒿琥酯所調(diào)控的鐵死亡還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究中，青蒿琥酯可有效地殺傷肝癌細(xì)胞，但只有在較大劑量（40μmol/L）時(shí)才能發(fā)揮較強(qiáng)的腫瘤殺傷作用。青蒿琥酯作為一種中藥提取物，如何把青蒿琥酯控制在安全劑量?jī)?nèi)，同時(shí)又能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)室正在積極嘗試各種藥物同青蒿琥酯的組合以尋找在較低的用藥劑量下即可達(dá)到有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。

綜上所述，通過感染HSPA5-shRNA病毒可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)青蒿琥酯的化療敏感度，其機(jī)制可能與鐵死亡引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分過氧化相關(guān)。