劉建紅

(天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，因其解剖位置較深和癥狀不明顯，是轉移早且確診晚的極具惡性度的腫瘤。由于該腫瘤易復發(fā)且對化療藥物存在耐藥性，使得患者5 年生存率很低，僅為30 %左右。卵巢癌80% ～90%來源于卵巢表面上皮細胞，其病因不明，一般認為與內分泌、環(huán)境、遺傳等多方面因素有關。近些年來，針對激素和上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma ，EOC)之間關系的研究頗多，一般認為上皮性卵巢癌為激素依賴性腫瘤，激素在上皮性卵巢癌的病因和輔助治療中發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學和現(xiàn)代免疫學的發(fā)展，細胞因子與腫瘤之間的作用機制為了解腫瘤的發(fā)生、轉移提供了新的思路。本實驗探討促性腺激素、細胞因子和上皮性卵巢癌的關系。

1 材料與方法

1.1材料人卵巢低分化乳頭狀腺癌細胞株(OVCAR-3)和人上皮性卵巢癌細胞株(Caov -3)均購自美國ATCC。OLYMPUS CK2 倒置式生物顯微鏡(日本OLYMPUS)、302 -01 型CO2孵箱(美國NATIONAL APPLIANCE COMPANY)、Microplate reader Model 550(美國BIO - RAD COMPANY)。FSH、LH、hrIL-6、抗-IL-6 抗體、四甲基偶氮唑藍(MTT)(sigma)購自北京舒伯偉公司;二甲基亞砜由蘇州第二化工研究所生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 各取對數(shù)生長期卵巢癌細胞懸液(2 ×105/ml)加入96 孔板中，每孔100 μl，每組6 孔，37 ℃，5%CO2，飽和濕度培育24 h 棄去培養(yǎng)基，更換含有10%活性炭吸附的胎牛血清RPMI 1640 或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以去除原胎牛血清所含激素對細胞生長的影響。加入相應的刺激因素:①加入不同終濃度的FSH 和LH(20、40、60、80 和100 IU/L)和不同終濃度FSH+抗IL-6 中和性抗體(50 μg/ml)的培養(yǎng)基200 μl;②加入不同終濃度hrIL -6(20、40、60、80 和100 μg/ml)和hrIL -6 + 抗IL -6 中和性抗體(50 μg/ml)的培養(yǎng)基200 μl。分別設置6 個平行對照孔，另設6 個不加藥的細胞培養(yǎng)基孔作為陰性對照，37 ℃培育96 h 后，在培養(yǎng)終止前4 h 加入MTT 溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37 ℃繼續(xù)培育4 h，棄去培養(yǎng)液。

1.2.2 細胞測定 在上述細胞中分別加入二甲基亞砜，每孔100 μl，稍振蕩后，置酶標儀上，在波長為490 nm 時測定吸光度(A)值。

1.2.3 計算細胞增殖率 細胞增殖率(%)=(實驗孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(對照孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100% 。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 軟件包進行統(tǒng)計學分析，試驗結果以±s 表示。用Excel 軟件對所獲得數(shù)據(jù)進行分析、處理圖表。

2 結果

2.1 促性腺激素對卵巢癌細胞系的促增殖作用及抗IL-6 中和性抗體對促性腺性激素促增殖作用的影響FSH 可促進OVCAR-3、Caov-3 細胞增殖。當FSH濃度為40IU/L 時，OVCAR-3 細胞和Caov-3 細胞株較對照組細胞增殖率分別增加了35%和67.7%，兩組比較，差異有顯著意義(P ＜0.05);當FSH 濃度為100 IU/L 時，兩種細胞增殖率較對照組細胞分別增加202%和192%，兩組比較，差異有非常顯著意義(P ＜0.01)。在卵巢癌細胞培養(yǎng)液中分別加入50 μg/ml 抗IL-6 中和性抗體，兩種卵巢癌細胞的生長均有所減慢，見圖1 和圖2。LH 的結果與FSH 的結果類似。無免疫活性的兔IgG 單獨與上述兩種細胞株培育，對細胞的增殖無影響。

2.2 rIL - 6 對卵巢癌細胞株的促增殖作用 在hrIL-6終濃度為100ng/ml 時，OVCAR -3 和Caov -3增殖率分別為對照組的394%和381%?？笽L -6 中和性抗體可封閉此作用，見圖3。無免疫活性的兔IgG單獨與上述兩種細胞株培育，對細胞的增殖均無影響。

圖1 不同濃度促性腺激素對OVCAR-3 的促增殖作用

圖2 不同濃度促性腺激素對Caov-3 的促增殖作用

圖3 hrIL-6 對卵巢癌細胞系的促增殖作用

3 討論

1977 年Besedovsky 等［1］提出“神經(jīng)內分泌免疫網(wǎng)絡”學說，認為內分泌和免疫系統(tǒng)在功能上是一個整體，兩組之間互相作用，互相制約，對肌體功能實施精密的調節(jié)，是肌體重要的調控系統(tǒng)。其共同的調節(jié)因子就是神經(jīng)肽和激素［2］。為了探索原發(fā)上皮性卵巢癌中神經(jīng)內分泌免疫網(wǎng)絡調節(jié)功能的變化及其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，檢測了①正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織和惡性卵巢癌組織中促性腺激素受體(FSHR)的表達情況。②促性腺激素(卵泡刺激素、黃體生成素)、hrIL-6 及抗IL -6 中和性抗體對卵巢癌細胞系OVCAR-3，Caov-3 細胞增殖的影響。③促性腺激素(卵泡刺激素、黃體生成素)、hrIL -6 及抗IL -6 中和性抗體對卵巢癌細胞系OVCAR -3 和Caov -3細胞核轉錄因子NF-kB 表達的影響。

長期以來，有兩種關于卵巢癌發(fā)生的假說已逐漸被人們接受，①高促性腺激素假說:持續(xù)的高促性腺激素對卵巢上皮的直接刺激或類固醇激素合成后的直接刺激，增加了惡變得可能;②持續(xù)排卵假說:垂體促性腺激素周期性刺激排卵，造成卵巢上皮反復損傷，再增殖修復過程中有絲分裂對卵巢上皮的長期、反復刺激，最終導致細胞的惡性轉化。兩種假設均在流行病學上得到支持。流行病學調查資料發(fā)現(xiàn):妊娠、哺乳、口服避孕藥可以降低卵巢癌發(fā)生的危險，這與抑制排卵及垂體促性腺激素分泌有關。Whittemore［3］發(fā)現(xiàn)使用促排卵藥物的婦女發(fā)生上皮性卵巢癌和交界性卵巢腫瘤的危險是有不孕史婦女的3 倍和4 倍。促排卵藥物可直接或間接地使促性腺激素超過生理循環(huán)濃度。性腺發(fā)育不全或兩性畸形患者長期受高水平促性腺激素的刺激，發(fā)生卵巢癌的幾率也會增加。另外，使用蓄積促性腺激素釋放激素拮抗劑的方法可以減低或遏制卵巢癌的發(fā)生率，其原理是此種拮抗劑可以抑制促性腺激素得釋放［4］。卵巢癌的高發(fā)期在婦女絕經(jīng)后10 ～20年內，而此時正是體內促性腺激素水平分泌升高時期。據(jù)報道促性腺激素可促進卵巢表面上皮及上皮性卵巢癌細胞增殖，抑制其凋亡，并在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤化療耐藥性中扮演重要角色。本研究中外源性 FSH 和 LH 可促進卵巢癌細胞株OVCAR-3和Caov - 3 增殖，這一結果證實了上述推斷。

FSH 可參與卵巢上皮分化、增殖、惡性變以及卵巢癌細胞的生長［5］。如果改變卵巢癌患者體內的內分泌環(huán)境，可有助于提高手術或化療效果，減少復發(fā)。而對高FSH 血癥的絕經(jīng)后婦女的內分泌進行調整，有可能減少卵巢癌的發(fā)生。本文選取2 個卵巢癌細胞株進行促性腺激素體外刺激實驗，發(fā)現(xiàn)在促性腺激素FSH 和LH 的作用下，細胞株OVCAR -3 和6Caov -3 的增殖能力加強，呈劑量依賴性，與Viqar Syed 等［6］的研究結果一致。但也有報道［7］，在體外實驗中FSH 對卵巢上皮性腫瘤的生長具有促進作用，而LH 卻擁有抑制其生長的作用，產(chǎn)生這種差異的原因可能是所選用細胞株的不同。通常人們認為FSH 通過與其細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體FSHR 結合發(fā)揮對細胞的作用。近些年來，針對促性腺激素在上皮性卵巢癌中的調控機制研究頗多，發(fā)現(xiàn)促性腺激素可通過調節(jié)一些細胞因子、生長因子和蛋白激酶等對上皮性卵巢癌發(fā)揮調控作用。本實驗著重探討在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中促性腺激素和IL-6 的作用。

Viqar Syed 等［6］研究證實，利用促性腺激素刺激卵巢癌細胞株可增加細胞IL -6 及IL -6 受體的表達，同時發(fā)現(xiàn)其增殖加快，而且IL-6 抗體抑制這種促增殖作用。本實驗雖然與Viqar Syed 等人所使用的細胞株不同，但也得出類似結果，說明IL -6 在卵巢癌細胞的增殖過程中起重要作用。IL -6 是一種具有多向性生物學效能的細胞因子，如誘導B 細胞分化和分泌抗體，激活T 細胞和造血細胞，誘導其他細胞因子產(chǎn)生等。正常卵巢上皮可持續(xù)分泌IL -6，在卵巢濾泡發(fā)育、周圍血管鞘形成過程中，內皮細胞可表達IL -6 mRNA，介導血管形成;在周期性排卵過程中，IL -6 可刺激上皮增生，參與卵巢表面破裂口的修復過程［8］?；A研究證實，在卵巢癌細胞培養(yǎng)的上清液中可測出IL-6 活性及IL-6 受體(IL-6R)mRNA 表達，并可刺激細胞的增殖［9］，本研究證實了這一點，發(fā)現(xiàn)外源性hrIL-6 可促進卵巢癌細胞株OVCAR -3 和Caov -3的增殖。

總之，上皮性卵巢癌的發(fā)生與患者體內促性腺激素水平的異常升高以及各種細胞因子比例失衡有著密切的聯(lián)系。本實驗觀察到促性腺激素及IL -6 對卵巢癌細胞系OVCAR -3 和Caov -3 具有促細胞增殖作用，另一個發(fā)現(xiàn)是抗白細胞介素-6 中和性抗體可部分抑制上述促細胞增殖。這些結果提示:體內促性腺激素異常升高在上皮性卵巢腫瘤形成的早期起到重要的作用，而一旦上皮性卵巢癌形成，激素與細胞因子共同影響其發(fā)展和轉歸。

1 Besedovsky H O，del Rey A. Immune -neuro -endocrine interactions:facts and hypotheses. Endocr Rev，1996 ，17(1):64

2 Blalock J E，Price V R，Reed C A，et al. Peptide hormones shared by the neuroendocrine and immunologic system. J Immunol，1985，135(2s):858

3 Whittemore A S. The risk of ovarian cancer after treatment for infertility.N Engl J Med，1994，331(12):805

4 Darcy V Spicer，Malcolm C Pike. Future possibilities in the prevention of breast cancer:Luteinizing hormone-releasing hormone agonists. Cancer Res，2000，2 (4):264

5 陳紅，胡琢英，鄧曉谷. 雌激素、孕激素及促性腺激素對卵巢癌細胞株H0 - 8910 體外生長的調控. 中山醫(yī)科大學學報，2001，22(1):29

6 Viqar Syed，Marambaud P，Shioi J，et al. Expression of gonadotropin receptor and growth responses to key reproductive hormones in normal and malignant human ovarian surface epithelial cell. Cancer research，2001，61(9):6768

7 Wenxin Zheng，Bibert S，Jaquinod M，et al. Ovarian epithelial tumor growth promotion by follicle - stimulating hormone and inhibition of the effect by luteinizing hormone. Gynecologic Oncology，2000，76(1):80

8 Lidor Y J，Xu F J，Martínez-Maza O，et al. Constitutive of macrophagecolony-stimulating factor and production interleukin-6 by human ovarian surface epithelial cells. Exp Cell Res，1993，207(2):332

9 Nilsson M B，Langley R R，F(xiàn)idler I J. Interleukin -6，secreted by human ovarian carcinoma cells，is a potent proangiogenic cytokine. Cancer Res，2005，65(23):10794