馬秀杰，王冠明，韓烈保，3

（1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所暨森林培育與保護(hù)省部共建實(shí)驗(yàn)室，北京100083；2.鴻銘控股有限公司，北京100020；3.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025）

“麥冬”指以麥冬為名的百合科沿階草族（Ophiopogoneae）沿階草屬（Ophiopogon）和山麥冬屬（Liriope）植物，在我國廣泛分布，除華北、東北和西北外，其他各?。▍^(qū)、市）均有分布。麥冬具有潤肺清津、養(yǎng)陰清熱的功能，塊根可入藥。一些麥冬品種具有四季常綠、耐踐踏、耗水少、易繁殖等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于園林綠化。麥冬的抗逆性、生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)于其他冷季型和暖季型草坪草［1］。目前全國以麥冬為名的沿階草屬有18個(gè)種（變種），山麥冬屬植物共有8個(gè)種（變種）［2］。麥冬類植物的分類混亂，山麥冬屬和沿階草屬的劃分一直存在爭(zhēng)議［3］，如湖北麥冬（L.spicata）與山麥冬（L.spicata）未開花時(shí)形態(tài)較為相似，難以鑒別［4］。因而，對(duì)我國不同產(chǎn)地的麥冬進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析具有重要意義。

近年來，我國有關(guān)麥冬遺傳多樣性和分子標(biāo)記的研究已逐漸展開。吳弢等［5］采用RAPD技術(shù)對(duì)4種山麥冬屬植物進(jìn)行了分類學(xué)研究，李風(fēng)濤和雷公藤［6］利用RAPD標(biāo)記對(duì)福建省內(nèi)不同產(chǎn)地的短葶山麥冬（L.muscari）進(jìn)行了種源研究。黃玉吉等［7］測(cè)定了7個(gè)不同產(chǎn)地麥冬（O.japonious）和山麥冬的rDNA-ITS序列。但上述研究選用的樣品相對(duì)較少，分布狹窄。鑒于此，本研究采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自全國不同產(chǎn)地的48份麥冬材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，分析麥冬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為麥冬的鑒定、種質(zhì)資源篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 對(duì)采自全國不同地區(qū)的98份麥冬進(jìn)行分株擴(kuò)繁后，選取48份材料進(jìn)行測(cè)試，其中野生種19個(gè)，栽培種29個(gè)（表1），野生種用 W標(biāo)識(shí)，栽培種用C標(biāo)識(shí)。

1.2 DNA的提取 取新鮮麥冬葉片，液氮研磨后采用改良的CTAB法分別提取其基因組DNA［8］。

1.3 引物篩選與PCR擴(kuò)增 SRAP所用引物及序列參照Li和Quiros發(fā)表的文獻(xiàn)［9］，引物由上海生工生物有限公司合成（表2）。首先選取4個(gè)具有代表性的材料（杭麥冬、川麥冬、闊葉山麥冬、山麥冬）對(duì)64種引物組合進(jìn)行篩選，獲得多態(tài)性好，且條帶清晰的11種引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25μL：模板DNA 50ng，TransTaq-T酶1.25U，10× TransTaq-T buffer 2.5 μL，dNTPs 0.2 mmol·L-1，上、下游引物各0.2μmol·L-1，加滅菌水至25μL。SRAP-PCR采用復(fù)性變溫法：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸10min，4℃條件下保存。

表1 供試材料及來源Table 1 Name and source of materials in this study

表2 本試驗(yàn)所用引物組合Table 2 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理 對(duì)清晰、可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定出現(xiàn)的有條帶的記為1，無帶的記為0，獲得0和1組成的原始矩陣。利用表型矩陣，統(tǒng)計(jì)SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)量。按照Nei-Li［10］相似系數(shù)的方法計(jì)算。

式中，X1、X2分別為成對(duì)比較的2個(gè)品種的擴(kuò)增帶數(shù)，X1，2為共有帶數(shù)。

采用（Nei-Li）遺傳相似系數(shù)、UPGMA 法［11］進(jìn)行聚類分析。數(shù)據(jù)處理采用DPSv 7.05軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地麥冬SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析 從64對(duì)引物組合中篩選出多態(tài)性好且條帶豐富的11對(duì)引物組合（表3），對(duì)48份麥冬種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共產(chǎn)生621條清晰條帶，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生56.45條多態(tài)性條帶。me3＋em7引物組合擴(kuò)增最多，為88條，me7＋em3引物組合擴(kuò)增出65條（圖1），me7＋em6擴(kuò)增最少，為36條。多態(tài)性總條帶數(shù)目為621條，平均多態(tài)性比率（PPB）達(dá)到100%。說明供試麥冬具有很高的遺傳多樣性。

表3 11對(duì)引物組合的SRAP擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplified results of SRAP with 11pairs of primers

圖1 引物組合me7＋em3對(duì)48份麥冬的的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SRAP amplification profiles of 48Lilyturfs with primer combination me7＋em3

2.2 遺傳距離與遺傳相似性分析 48份供試麥冬材料的相似系數(shù)GS值為0.058 4～0.936 7，平均為0.497 5，變幅為0.878 3，遺傳距離GD為0.066 3～0.941 6，平均為0.504，變幅為0.875 3。來自江蘇沭陽的7號(hào)日本矮生沿階草與來自廣西南寧的9號(hào)麥冬遺傳距離最小，為0.066 3，說明兩者具有較近的親緣關(guān)系。來自云南西雙版納的44號(hào)高腳沿階草與來自四川三臺(tái)的1號(hào)川麥冬遺傳距離最大，為0.941 6，說明兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析結(jié)果表明，供試材料之間遺傳相似度低，差異明顯。

2.3 不同產(chǎn)地麥冬種質(zhì)聚類分析 在遺傳距離0.81處可將供試材料分成六大類（圖2）。第Ⅰ類共13份材料，又可分為2個(gè)亞類。第1亞類供包括10個(gè)材料，主要為產(chǎn)地不同的麥冬，第2亞類有3個(gè)材料，全部為沿階草。第Ⅱ類19份材料，分屬麥冬（O.japonicus）、山麥冬（L.spicata）、闊葉山麥冬（L.platyphylla）、短葶山麥冬（L.muscari）、禾葉山麥冬（L.graminifolia）5個(gè)種。其中3、5、8號(hào)為麥冬，與其他材料遺傳距離較遠(yuǎn)，優(yōu)先聚為一個(gè)亞類，27、28、29號(hào)闊葉山麥冬、30號(hào)金邊闊葉麥冬和31號(hào)短葶山麥冬麥冬5份材料聚為一個(gè)亞類。第Ⅲ類共12份材料，除40號(hào)外，其余皆為沿階草，云南材料占該類群的75%。第Ⅳ類僅一份材料，形態(tài)學(xué)上鑒定為矮小沿階草（O.bodinierivar.pygmaeus），23、24和25號(hào)聚為一類。第Ⅴ類為細(xì)葉銀邊沿階草（O.intermediuscv.Argenteo-marginatus）。第Ⅵ類包括兩個(gè)沿階草材料。

圖2 48份麥冬種質(zhì)遺傳距離分析聚類圖Fig.2 Dendrogram of 48Lilyturf accessions based on SRAP

3 討論

SRAP分子標(biāo)記是由Li和Qurios［9］于2001年提出的一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記方法。SRAP技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速，不需預(yù)知物種的序列信息等特點(diǎn)，在植物遺傳多樣性分析［12］和種質(zhì)鑒定［13］方面得到了廣泛應(yīng)用。近年來，SRAP開始應(yīng)用于結(jié)縷草（Zoysiajaponica）［14］、野牛草（Buchloedactyloides）［15］和狗牙根（Cynodondactylon）［16］等草坪草和牧草的遺傳多樣性分析。本試驗(yàn)篩選出11對(duì)條帶清晰、可重復(fù)的引物，共擴(kuò)增出621條譜帶，平均多態(tài)性比率為100%。SRAP分子標(biāo)記中，種內(nèi)平均多態(tài)比率達(dá)90%以上的報(bào)道相對(duì)較少，多見于種間。劉曉宏［17］對(duì)31份漆樹（Toxicodendron vernicifluum）種質(zhì)進(jìn)行SRAP分析，11對(duì)引物組合擴(kuò)增條帶平均多態(tài)性比率為98.04%。劉建豐［18］對(duì)29份野生煙草（Nicotianatabacum）種質(zhì)進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，18對(duì)引物組合擴(kuò)增多態(tài)性比率達(dá)到100%。陶愛芬等［19］用23對(duì)引物組合對(duì)96份黃麻（Corchoruscapsularis）種質(zhì)資源進(jìn)行SRAPPCR擴(kuò)增，多態(tài)性比率也為100%。

本研究選用的麥冬類材料分屬麥冬屬和沿階草屬，分化明顯、多樣性突出，表型豐富。擴(kuò)增結(jié)果表明，使用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地對(duì)麥冬進(jìn)行遺傳多樣性分析。余伯陽和徐國鈞［2］觀察了湖北麥冬與山麥冬兩種植物的塊根和葉的組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者之間無明顯差異，因此認(rèn)為湖北麥冬的分類學(xué)位置有待進(jìn)一步研究。吳弢等［5］對(duì)4種麥冬進(jìn)行RAPD遺傳多樣性分析后認(rèn)為，湖北麥冬與山麥冬的相對(duì)遺傳距離大于山麥冬與闊葉山麥冬的相對(duì)遺傳距離，湖北麥冬和山麥冬應(yīng)該為兩個(gè)種。本研究采用SRAP分子技術(shù)對(duì)48種麥冬的遺傳多樣性分析顯示，14號(hào)湖北麥冬與來自不同產(chǎn)區(qū)的19、20、21和22號(hào)山麥冬可聚為一大類，但是相對(duì)遺傳距離大于同類中來自不同產(chǎn)區(qū)的26、27、28、29和30號(hào)麥冬，進(jìn)一步支持了吳弢等［5］的觀點(diǎn)。31號(hào)短葶山麥冬與26、27、28、29和30號(hào)闊葉山麥冬可聚為一類，且遺傳距離非常小，這與徐炳聲和李林初［20］的闊葉山麥冬和短葶山麥冬無明顯界限，闊葉山麥冬為短葶山麥冬變種的觀點(diǎn)一致。

Wilson等［21］認(rèn)為種質(zhì)的地理分布與分子標(biāo)記間存在相關(guān)性，在苜蓿（Medicagosativa）22、狗牙根［23］、白三葉（Trifoliumrepens）［24］等草坪草和牧草上的遺傳分析也證實(shí)了來自相似地理環(huán)境的種質(zhì)可以優(yōu)先聚為一類。本研究通過對(duì)產(chǎn)地不同的麥冬進(jìn)行SRAP統(tǒng)計(jì)分析和聚類分析，發(fā)現(xiàn)供試材料也呈現(xiàn)一定的地域分布規(guī)律。第Ⅰ類群來自四川的1和2號(hào)以及來自浙江的4和6號(hào)分別聚在一起，可能與它們起源以及分布相似性有關(guān)。第Ⅱ類群中，來自北京的3、15和16號(hào)生態(tài)環(huán)境相似，也可以聚在一起。第Ⅲ類群中，來自云南的32、34、35、36、38、41、42、43、46和47號(hào)沿階草材料可以聚為一類，這可能由于云南特有的海拔高度、土壤氣候及降雨對(duì)沿階草的自然選擇造成的影響，使得該地區(qū)材料基因型趨近一致。來自浙江慈溪的5號(hào)栽培種麥冬及6號(hào)野生種麥冬未能聚在一起，這可能是由人為選擇導(dǎo)致的。

［1］張進(jìn)友.優(yōu)良的草坪地被植物沿階草［J］.草業(yè)科學(xué)，2003，22（2）：69-70.

［2］余伯陽，徐國鈞.麥冬類中藥的藥源調(diào)查和商品鑒定［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，22（3）：150-153.

［3］Hume H H.The Ophiopogon-Liriope complex［J］.Baileya，1961，9（46）：134-158.

［4］劉霞，曹秀榮，陳科力，等.湖北麥冬的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（10）：1231-1234.

［5］吳弢，周開亞，王義權(quán)，等.RAPD在山麥冬屬四種植物分類中的應(yīng)用［J］.中草藥，1998，29（1）：37-40.

［6］李風(fēng)濤，雷公藤.基于道地藥材短葶山麥冬RAPD種源鑒別研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009：32-34.

［7］黃玉吉，陳菁瑛，蘇海蘭，等.不同產(chǎn)區(qū)麥冬、山麥冬rDNA-ITS序列分析［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，24（6）：508-512.

［8］王冠明，韓烈保，馬秀杰，等.麥冬基因組DNA提取方法研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010（6）：100-106.

［9］Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging inBrassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.

［10］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in term of restriction endonucleases［J］.Proceeding of the national Academy Scineces，1979，76：5269-5273.

［11］Rohlf F J.NTSYS-pc.Nuberical Taxonomy and Multivariate Analysis System （Version 2.0）［M］.New York：Exeter Software，2001：16-29.

［12］Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbitapepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：271-282.

［13］張建成，王傳堂，焦坤，等.SRAP標(biāo)記技術(shù)在花生種子純度鑒定中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（12）：35-39.

［14］郭海林，鄭軼琦，陳宣.結(jié)縷草屬植物種間關(guān)系和遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（5）：201-210.

［15］周瑩潔，王顯國，張新全.野牛草種質(zhì)基于SRAP標(biāo)記的遺傳多樣性研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2011，28（11）：1930-1935.

［16］王志勇，袁學(xué)軍，劉建秀.狗牙根SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：79-85.

［17］劉曉宏.漆樹種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的SRAP分析［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009：27-41.

［18］劉建豐.煙草核心種質(zhì)DNA遺傳多樣性研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007：34-39.

［19］陶愛芬，祁建民，粟建光，等.SRAP和ISSR及兩種方法結(jié)合在分析黃麻屬起源與演化上的比較［J］.作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：2277-2284.

［20］徐炳聲，李林初.短葶山麥冬種群分類問題的探討［J］.植物分類學(xué)報(bào)，1980，19（4）：456-461.

［21］Wilson B L，Kitzmilier J，Rolle W，etal.Isozyme variation and its environmental correlates inElymus glaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139-153.

［22］何慶元，吳蘋，張曉紅，等.不同秋眠性苜蓿SRAP體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：201-209.

［23］凌瑤，張新全，齊曉芳，等.西南五省區(qū)及非洲野生狗牙根種質(zhì)基于SRAP標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：196-203.

［24］張婧源，彭燕，羅燕，等.不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（5）：130-138.