成凱凱，魏小蘭，杜 鵑，張?zhí)N薇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所，北京100193）

野牛草（Buchloedactyloides）為多年生暖季型C4草本植物，是生長(zhǎng)在北美草原上最古老的禾本科植物之一，起源于美洲中南部［1］，自然群落主要分布在美國(guó)、加拿大、墨西哥中部的干旱地帶［2］，常與格蘭馬草（Boutelouagracilis）等一起構(gòu)成草原景觀［3］。因其具有很多優(yōu)良特性及較好的坪用性狀（如耐旱、植株低矮、葉片纖細(xì)柔軟等）而逐漸被用于草坪種植，又因具有優(yōu)越的抗病蟲能力、抗旱性及適應(yīng)性，日益成為我國(guó)華北、東北、西北等地區(qū)園林綠化、環(huán)境保護(hù)、水土保持的主要草種之一。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）是近年來(lái)一種以微衛(wèi)星為引物的新型PCR分子標(biāo)記技術(shù)［4］。目前常用的ISSR引物是由加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）設(shè)計(jì)的96個(gè)ISSR 引物［5］。近年來(lái)ISSR技術(shù)已在品種鑒定［6-7］、遺傳作圖［8-9］和居群遺傳學(xué)［10］等研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。

本研究通過對(duì)30份不同地理來(lái)源的野牛草種質(zhì)資源坪用性狀的測(cè)定以及ISSR分子標(biāo)記，分析供試材料的遺傳多樣性，檢測(cè)材料的遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，通過聚類分析初步將種質(zhì)歸類，選擇性狀優(yōu)良且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)作為將來(lái)育種的材料，同時(shí)為野牛草種質(zhì)資源的保護(hù)及利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 本試驗(yàn)的30份野牛草種質(zhì)搜集于美國(guó)和中國(guó)，地理來(lái)源不同，2007年移栽至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站。地理位置115°50′E，40°02′N，海拔50m。暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫11.4℃，絕對(duì)最低溫-21.7℃，絕對(duì)最高溫為41.6℃，年平均降水量628mm。全年無(wú)霜期211d。由于特殊原因，具體地理來(lái)源已不明。

1.2 田間觀測(cè) 于2010年7月-2011年7月進(jìn)行田間觀測(cè)。從開花期開始測(cè)定的形態(tài)學(xué)指標(biāo)有葉長(zhǎng)、葉寬、株高、莖粗、匍匐莖長(zhǎng)度、匍匐莖數(shù)目和匍匐莖節(jié)數(shù)；成熟期測(cè)定的生理指標(biāo)包括葉色和葉片枯黃程度。其中選中的葉片在單株中用線和標(biāo)牌分別進(jìn)行標(biāo)記，以便進(jìn)行連續(xù)觀測(cè)。

葉長(zhǎng)：開花期，隨機(jī)選取任意分蘗枝下端第2片葉片用直尺測(cè)定其長(zhǎng)度，重復(fù)3次。

葉寬：開花期，用游標(biāo)卡尺測(cè)定以上選取的葉片中部的寬度，重復(fù)3次。

株高：用直尺測(cè)定野牛草的絕對(duì)高度，從開花期開始連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔10d。

莖粗：開花期，隨機(jī)選取任意分蘗枝，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其莖基部的直徑，同一植株3個(gè)重復(fù)。

分蘗數(shù)：在分蘗期、開花期和結(jié)實(shí)期各測(cè)定1次。

匍匐莖長(zhǎng)度：用直尺測(cè)定，從開花期開始連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔10d。

匍匐莖節(jié)數(shù)：統(tǒng)計(jì)測(cè)定的最長(zhǎng)匍匐莖的節(jié)數(shù)，從開花期開始連續(xù)統(tǒng)計(jì)3次，每次間隔10d。

匍匐莖數(shù)目：從開花期開始連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔10d。

葉色：在野牛草成熟期（7和8月），每株隨機(jī)選取任3個(gè)葉片采用葉綠素測(cè)定儀（SPAD儀）測(cè)定SPAD值，并對(duì)選定葉片做記號(hào)，重復(fù)3次。

葉片枯黃程度：2010年10月4日、10月14日和10月24日每個(gè)單株標(biāo)記3個(gè)葉片，分別測(cè)定葉片總長(zhǎng)度和枯黃部分的長(zhǎng)度，以枯黃部分占葉片總長(zhǎng)度的比值表示葉片枯黃程度。

1.3 野牛草基因組DNA的提取 選取野牛草健康幼葉，用CTAB法［11］提取其基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，合格的DNA樣品于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR-PCR體系的建立及優(yōu)化 根據(jù)之前發(fā)表的ISSR-PCR反應(yīng)體系［12-17］，經(jīng)優(yōu)化后得到下述體系：總體積25μL，其中1×buffer 1.5μL、dNTP 0.3mmol·L-1、Taq酶1.0U、Primers 0.6 μmol·L-1、Mg2＋1.0mmol·L-1、DNA 模板50 ng，雙蒸水補(bǔ)足25μL。

1.5 引物篩選和PCR反應(yīng) 本試驗(yàn)中ISSR反應(yīng)采用的引物序列均由加拿大哥倫比亞大學(xué)提供，由上海生物工程公司合成，共33條［18］。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，48～60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存［12］。

1.6 電泳檢測(cè) 本試驗(yàn)采用的是12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，以盛旭百川生物科技公司生產(chǎn)的DL2000為Marker，110V電壓下電泳4h，停止電泳后在0.1%硝酸銀溶液中銀染，NaOH溶液中顯影，然后拍照，供數(shù)據(jù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析 田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2進(jìn)行差異顯著性分析和聚類分析。

分子試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方面，對(duì)獲得的清晰可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上，根據(jù)條帶的有無(wú)記為1或0，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。

根據(jù)原始矩陣，統(tǒng)計(jì)得到的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，通過計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（Percentage of Polymorphic Bands，PPB），引物多態(tài)性含量（Polymorphism Information Content，PIC）和遺傳相似系數(shù)（GS）來(lái)估計(jì)遺傳多樣性。

式中，TNB指ISSR擴(kuò)增的總條帶數(shù)（Total Number of Bands），NPB指多態(tài)性條帶數(shù)（Number of Polymorphic Bands）；PIC＝1-∑Pi2，Pi為i位點(diǎn)的基因頻率。

式中，Nij為材料i和j共有的擴(kuò)增條帶數(shù)，Ni為材料i的擴(kuò)增條帶數(shù)，Nj為材料j的擴(kuò)增條帶數(shù)；遺傳距離GD＝1-GS。利用NTSYS-PC 2.10軟件計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，根據(jù)GS值按不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)野牛草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳相似性聚類和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理來(lái)源野牛草的坪用性狀觀測(cè)30份不同地理來(lái)源的野牛草單株相互之間在基本坪用性狀上存在很大差異。葉長(zhǎng)、葉寬、株高、匍匐莖長(zhǎng)度和匍匐莖節(jié)數(shù)差異極顯著（P＜0.01）；莖粗、葉色呈顯著差異（P＜0.05）；分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)目和葉片枯黃程度無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

根據(jù)形態(tài)學(xué)指標(biāo)可將30份不同地理來(lái)源野牛草分為4類，第Ⅰ類材料有16份，包括2、3、4、5、7、8、12、14、16、17、19、21、22、25、28、29；第 Ⅱ 類 材料7份，包括9、10、11、23、24、26、27；第Ⅲ類材料3份，包括1、6、30；第Ⅳ類材料4份，包括13、15、18、20（圖1）。

表1 不同地理來(lái)源野牛草坪用性狀觀測(cè)Table 1 Observation of turf characteristics of 30different geographical origin Buchloe dactyloides

2.2 供試材料ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析從33條引物中選擇了7條［18］擴(kuò)增條帶多態(tài)性好、清晰穩(wěn)定的引物對(duì)30份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的檢測(cè)，部分結(jié)果見圖2。

30份野牛草材料經(jīng)過7個(gè)引物的擴(kuò)增共獲得108條條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)目為90條，多態(tài)性比率為83.3%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出條帶15.4條，PIC值的變化范圍為0.78～0.89，平均值是0.85（表2）。所選用的7條引物基本上均能獨(dú)立地將30份野牛草區(qū)分開來(lái)，這說(shuō)明不同地理來(lái)源的供試野牛草間具有較大的遺傳變異和較豐富的遺傳多態(tài)性，同時(shí)表明了ISSR分子標(biāo)記可以用來(lái)檢測(cè)野牛草屬種間親緣關(guān)系。

2.3 野牛草種質(zhì)的親緣關(guān)系分析 遺傳相似系數(shù)和遺傳距離是評(píng)價(jià)群體間、群體內(nèi)DNA變異水平的重要參數(shù)。遺傳相似系數(shù)越大，說(shuō)明群體間的親緣關(guān)系越近；遺傳相似系數(shù)越小，說(shuō)明群體間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。

本試驗(yàn)利用篩選的7條ISSR引物對(duì)30份不同地理來(lái)源的野牛草基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)出108個(gè)位點(diǎn)，通過NTSYS-PC 2.10進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析。不同地理來(lái)源野牛草種質(zhì)資源的GS值變化范圍為0.546～0.880，其中材料22和23、材料30和37的遺傳相似性系數(shù)最高，為0.880，遺傳距離較近；材料3和材料39的遺傳相似性系數(shù)最低，只有0.546，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（表3）。

圖1 30份不同地理來(lái)源野牛草資源的表型聚類圖Fig.1 Phenotype UPGMA-derived dendrogram of 30 different geographical origin Buchloe dactyloides

圖2 引物TP2聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 Results of PCR amplification with primer TP2

表2 用于ISSR分子標(biāo)記的引物以及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The primers and the results of ISSR amplification

2.4 野牛草種質(zhì)的聚類分析 利用ISSR分子標(biāo)記在遺傳相似系數(shù)為0.690時(shí)能將30份野牛草資源分為5類，第Ⅰ大類包括3份材料（1、6、10）；第Ⅱ大類包括20份材料：在遺傳相似系數(shù)為0.710時(shí)，第Ⅱ大類材料又分為4個(gè)亞類，第1亞類為材料2和材料9，其GS值為0.701，第2亞類共7份材料（3、26、31、32、33、36、38），第3亞類包括8份材料（11、12、13、15、23、24、29、35），第4亞類共3份材料（17、21、28）；第Ⅲ大類包括3份材料（4、18、22）；第Ⅳ大類包括3份材料（7、30、37）；第Ⅴ大類僅為材料39。聚類分析直觀地表明了不同野牛草材料之間的

2.5 野牛草材料的主成分分析 基于GS值，利用NTSYS-PC 2.10軟件對(duì)不同地理來(lái)源的野牛草材料進(jìn)行主成分分析，根據(jù)第一、第二主成分作圖（圖4），得到30份野牛草材料的位置分布情況，位置靠近者表示其具有較近的親緣關(guān)系，位置遠(yuǎn)離者表示其關(guān)系較遠(yuǎn)。將位置靠近者劃在一起，供試野牛草材料大致可以分為5組，即第1組包括材料7、30、37，第2組包括材料4、18、22，第3組包括材料1、3、26、31、32、33、36，第4組包括2、9、11、12、15、17、2 1、23，第5組包括6、10、13、24、28、29、35、38、39。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，并且主成分分析結(jié)果在表明不同野牛草材料之間的親緣關(guān)系方面更加直觀。

圖3 30份材料基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram based on GS genetic similarity coefficients4

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圖4 30份野牛草材料基于遺傳相似系數(shù)的主成分分析Fig.4 The principal coordinate analysis（PCA）based on genetic similarity coefficients

2.6 結(jié)合田間試驗(yàn)與分子試驗(yàn)的結(jié)果分析結(jié)合田間試驗(yàn)與分子試驗(yàn)的聚類結(jié)果，下列材料的兩種聚類結(jié)果一致：材料2與材料9在田間試驗(yàn)中被聚為第Ⅰ大類，在分子試驗(yàn)中聚為第Ⅱ大類中的第一亞類；材料4、18和22在田間試驗(yàn)中聚為第Ⅰ大類，在分子試驗(yàn)中聚為第Ⅲ大類；材料11、12、13、31、32、35和36在田間試驗(yàn)中聚為第Ⅱ大類，在分子試驗(yàn)中31、32和36聚為第Ⅱ大類中的第二亞類，11、12、35和13聚為第Ⅱ大類中的第三亞類；材料1 7、21、24和28在田間試驗(yàn)中聚為第Ⅳ大類，在分子試驗(yàn)中聚為第Ⅱ大類中的第三亞類。

3 討論

本研究中30份不同地理來(lái)源的野牛草單株之間在基本坪用性狀上存在很大差異，其中葉長(zhǎng)、葉寬、莖粗、株高、匍匐莖長(zhǎng)度和匍匐莖節(jié)數(shù)差異極顯著（P＜0.01），葉色呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)目和葉片枯黃程度沒有顯著差異。形態(tài)學(xué)指標(biāo)的差異顯著性分析結(jié)果說(shuō)明，供試材料間具有豐富的遺傳背景，表型多樣性較好，根據(jù)形態(tài)學(xué)指標(biāo)能將所有材料聚為4類，這為初步推斷其來(lái)源地是否相同提供了直觀的信息，同時(shí)為選擇性狀優(yōu)良植株進(jìn)行育種提供佐證。

分子試驗(yàn)方面，從ISSR標(biāo)記的結(jié)果來(lái)看，一共得到了108條條帶，90條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性信息含量為0.850，說(shuō)明這30份材料具有較豐富的多態(tài)性，同時(shí)也說(shuō)明了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有高效、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，同時(shí)也克服了RAPD重復(fù)性低、AFLP成本高和SSR需要測(cè)定重復(fù)序列兩端的序列信息等缺點(diǎn)，表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)于分析野牛草的遺傳多樣性方面是有效的，可以用作野牛草育種的輔助工具，同時(shí)本研究的結(jié)論為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在野牛草屬植物上進(jìn)一步研究中的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他植物的研究中［13，19-24］。

從之前的研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR標(biāo)記聚類群體與其地理位置的分布有一定的關(guān)系，地理位置接近的多數(shù)材料都聚成一類［25-26］。遺傳距離從一定程度上反映出群體間遺傳差異程度。一般認(rèn)為材料間的遺傳距離越大，它們產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢(shì)就有可能越大，但是對(duì)于不同作物和牧草，遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系不同且較為復(fù)雜。本研究利用ISSR標(biāo)記對(duì)30份不同地理來(lái)源野牛草的遺傳多樣性聚類分析，遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.546～0.880，其中材料22和23、材料30和37的遺傳相似性系數(shù)最高，為0.880，遺傳距離較近；材料3和材料39的遺傳相似性系數(shù)最低，只有0.546，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過對(duì)遺傳距離的分析可以得出，供試材料之間具有遺傳基礎(chǔ)廣闊、遺傳多樣性豐富的特點(diǎn)。這在主成分分析結(jié)果中也得到了證實(shí)，主成分的結(jié)果和聚類結(jié)果大體一致，但是有少部分材料通過兩種分析的結(jié)果不盡相同，大部分材料在空間圖上所處的空間位置較遠(yuǎn)，這可能與野牛草復(fù)雜的倍性有關(guān)。Johnson等［27］等研究了美國(guó)野牛草主要分布區(qū)域的染色體水平狀況，發(fā)現(xiàn)美國(guó)主要分布區(qū)的野牛草的染色體水平主要有二倍體、四倍體、五倍體及六倍體4種類型。其中，六倍體野牛草（73%）是自然分布的主體類型，在采集地均有分布，四倍體野牛草（23%）主要分布在美國(guó)的西部地區(qū)，二倍體野牛草（2.6%）的野生種群只分布在墨西哥東部地區(qū)和德克薩斯州西北部，在野外也發(fā)現(xiàn)了少量的五倍體（1.8%）。遺傳距離分析及聚類分析的結(jié)果從分子水平進(jìn)一步說(shuō)明了供試種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異。野牛草植物豐富的遺傳變異為野牛草屬植物的優(yōu)良品系選育、開發(fā)和利用提供了空間，避免了因遺傳基礎(chǔ)狹窄而給育種工作造成的限制。因此，對(duì)野牛草屬植物進(jìn)行深入研究，選育優(yōu)良的新品種具有資源方面的優(yōu)勢(shì)也具有開發(fā)潛力。

結(jié)合田間試驗(yàn)與分子試驗(yàn)的聚類結(jié)果，有些材料在兩種聚類分析中都聚為一類，表現(xiàn)出了較好的一致性，這些材料地理來(lái)源很有可能相同，該結(jié)果為優(yōu)良野牛草種質(zhì)資源的篩選提供了可靠的依據(jù)，同時(shí)揭示了不同地理來(lái)源野牛草種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，為野牛草種質(zhì)資源的利用以及保護(hù)提供了依據(jù)。

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