王爍，蔣明蔚，李曉斌，賈楠

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

蜂膠(propolis)是蜂產(chǎn)品中一類十分重要的天然物質(zhì)，是蜜蜂從植物芽孢及樹干上采集的樹膠，并混入蜜蜂上顎分泌物和蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。其中含50%～55%樹脂，30% ～40%蜂蠟，5% ～10%花粉，還有油脂，氨基酸等［1-2］。近年來，國內(nèi)外對(duì)蜂膠的藥理作用進(jìn)行了大量的研究。發(fā)現(xiàn)蜂膠內(nèi)含有的黃酮類物質(zhì)是重要的活性成分［3］。它對(duì)多種疾病(如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、肝病、腸胃病等)具有十分明顯的醫(yī)療保健功效［4-6］。

目前，國內(nèi)外測定黃酮含量的方法有很多種［7-9］，如聚酰胺樹脂吸附法［10］，高效液相色譜法，熒光法，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測法［11］等。其中，用聚酰胺樹脂吸附法測總黃酮時(shí)，用苯洗脫層析柱，會(huì)把蜂膠中一些弱極性的黃酮洗掉。高效液相色譜法測的是蜂膠中高良姜素、山奈酚、槲皮素、楊梅酮、松鼠素、芹菜素、蘆丁、柯因的含量，至于總黃酮的含量，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測是有機(jī)物質(zhì)含量比較準(zhǔn)確的檢測方法，但是由于氣質(zhì)聯(lián)用檢測設(shè)備投入比較大，操作要求嚴(yán)格，因此這種方法很難在生產(chǎn)企業(yè)中推廣應(yīng)用。分光光度比色法是易于推廣的測定總黃酮方法，但是大多數(shù)方法中都是測定蜂膠制品的黃酮含量，并沒有一種針對(duì)蜂膠膠囊內(nèi)容物的測定方法。市面上90%以上的蜂膠產(chǎn)品皆為蜂膠膠囊，因此，建立一種快速準(zhǔn)確而又操作簡單的測定蜂膠膠囊中總黃酮的方法是極為必要的。

本文選擇簡便安全的紫外分光光度法，測定蜂膠膠囊中總黃酮的含量，且與國標(biāo) GB/T20574-2006［12］方法比對(duì)，試驗(yàn)表明，2種顯色劑測定結(jié)果無顯著性差異，該方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，簡便快速。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

梅特勒AL204-IC電子天平，普析通用T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，天津泰斯特DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，津騰隔膜真空泵GM-0.33II。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

聚酰胺粉，60～90目;蘆丁對(duì)照品，純度≥95%;體積分?jǐn)?shù)95%乙醇;無水乙醇。

乙醇溶液(30%):量取無水乙醇溶液300 mL，加水溶解，定容于1 000 mL容量瓶中，搖勻。

醋酸鉀溶液(0.98 g/L):稱取醋酸鉀9.814 g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

硝酸鋁溶液(100 g/L):稱取 Al(NO3)3·9H20 17.60 g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

亞硝酸鈉溶液(50 g/L):稱取NaNO25g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

氫氧化鈉溶液(100 g/L):稱取 NaOH10g，加水溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

所有試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水;實(shí)驗(yàn)樣品為某品牌膠囊。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原理

蜂膠是含有黃酮類的化合物。黃酮化合物的母核中某些位置如C3和C5上含有羥基時(shí)能與鋁、鉛等金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，這些絡(luò)合物在光譜上產(chǎn)生明顯變化。黃酮與金屬離子的這種作用不僅可以用于鑒別這類成分中羥基的位置，還可以作為進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)就是采用這種原理，通過Al3+與黃酮形成絡(luò)合物在最大吸收波長處有一吸收峰然后比色測定而進(jìn)行定量的。

1.2.2 樣品溶液的制備

(1)稱取某品牌蜂膠囊液體0.4 g于燒杯內(nèi)，加少量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，65℃水浴45 min攪拌使之溶解，取出后冷卻至室溫，分?jǐn)?shù)次洗入50 mL容量瓶中，至乙醇溶液無色。用95%乙醇溶液定容至50 mL，搖勻，靜置。精密吸取上清液5 mL于小燒杯中，加少量聚酰胺粉吸附，用真空泵抽濾，且用95%乙醇溶液分次清洗，濾液收集至25 mL比色管中，用95%乙醇溶液定容，搖勻，即得樣品溶液1。

(2)稱取液體0.4 g于燒杯內(nèi)，加20 mL 95%乙醇溶液，65℃水浴45 min攪拌使之溶解，取出后冷卻至室溫，上清液使用濾紙過濾，燒杯、濾紙、漏斗、殘?jiān)蒙倭恳掖枷礈熘翞V液無色，定容至50 mL，搖勻即得樣品溶液2。

1.2.3 蘆丁供試品溶液的制備

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻即得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取10 mL于50 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉作顯色劑測定黃酮含量(方法一)

1.2.4.1 最大吸收波長的選擇

精密吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL于10 mL比色管中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，放置6 min，然后加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，放置 6 min，再加入4 mol/LNaOH溶液1 mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，在分光光度計(jì)上，在波長200～600 nm內(nèi)掃描，得出吸收光譜，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁的吸收光譜

從圖1可以看出，在510 nm時(shí)有最大吸光度，所以實(shí)驗(yàn)選擇波長510 nm處測定。

1.2.4.2 顯色劑用量及放置時(shí)間試驗(yàn)

吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，于10 mL比色管中，各加一定量的5%NaNO2溶液，搖勻后放置一段時(shí)間，加入一定量的10%Al(NO3)3溶液，搖勻后放置一段時(shí)間，再加入一定量的4 mol/L的NaOH溶液，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，于510 nm處測定吸光值。如表1所示。

所得結(jié)果為，最佳的顯色劑用量和放置時(shí)間是:加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min加入4 mol/LNaOH溶液1 mL，此時(shí)有最大吸光值。

讀者們，去繪制一張記憶的地圖。記憶許給你的是一個(gè)遠(yuǎn)景，它包括那些最為隱秘的信息和最為順從的感情與感覺。我們的一切解釋都來源于眼睛，因?yàn)槿耸甲杂谘劬Γ渌亩际切┎牧?，它們沒有回應(yīng)能力又饒舌。我們通過眼睛觀看，也通過眼睛來確認(rèn)。我們有視覺的精明機(jī)警和當(dāng)下的清晰透澈，但回憶卻認(rèn)為在我們說出之前的一切都是它給我們的。慢慢地就這樣我們有了這樣一種認(rèn)識(shí)，即為我們所有的這個(gè)“這里”其實(shí)是記憶的一個(gè)花招，因?yàn)橛洃浻幸飞蟿e的更多的記憶的壓力，即將來，因而它必須給自己一個(gè)定位。徐浡君將這兩者都統(tǒng)一起來了，即過去和現(xiàn)在，也就是說，通過這兩者他得到了未來。

1.2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL蘆丁供試品溶液2.00 mL于10 mL比色管中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min加入4 mol/LNaOH溶液1 mL，以空白試液為參比，在波長510 nm處以不同時(shí)間間隔測定吸光度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表2，結(jié)果表明吸光度在標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色15 min吸光度最大，15～18 min內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，20 min后吸光度明顯減小，故實(shí)驗(yàn)選擇顯色后15 min比色。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)準(zhǔn)確吸取蘆丁供試品溶液0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，3.00 mL，分別置于6個(gè)10 mL比色管中。

(2)于上述比色管中各加95%乙醇使成5 mL，分別加5%NaNO2溶液0.3 mL，放置6 min，然后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，放置6 min，再加入4 mol/LNaOH溶液1 mL，用95%乙醇定容，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的比色管中的溶液為空白的參比，510 nm波長處測定吸光度。

根據(jù)表3所測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得回歸方程為Y=1.244 4X+0.001 5，r2=0.999 9。

結(jié)果表明蘆丁含量在0.0～0.6 mg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(如圖2所示)。其蘆丁含量、吸光度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表3:

精密吸取0.2 mg/mL蘆丁供試品溶液2 mL于10 mL比色管中，按1.2.4.4(2)實(shí)驗(yàn)操作，以空白試液為參比，在波長510 nm處測定吸光度，連續(xù)8次。

實(shí)驗(yàn)所測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表4，RSD為0.138%，表明儀器精密度良好。

表1 顯色劑用量及放置時(shí)間試驗(yàn)

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖2 方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表4 精密度實(shí)驗(yàn)

1.2.4.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量(90.0 mg/g)的某品牌蜂膠6份，按下表分別加入不同量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按實(shí)驗(yàn)1.2.2.1方法制備溶液，各取2.5 mL于10 mL比色管里，按實(shí)驗(yàn)1.2.4.4(2)方法顯色，測定吸光度，計(jì)算結(jié)果見下表5:

表5 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)中，平均回收率為 99.55%，RSD值為1.41%，小于3%，說明方法的準(zhǔn)確度良好。

1.2.4.7 方法的檢出限

根據(jù)國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)IUPAC給出的

表6 20次測定空白溶液的吸光值

根據(jù)上表數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)的取樣量，方法測定過程中的稀釋倍數(shù)計(jì)算可得出，本方法的檢出限為1.25 mg/g。

1.2.5 用硝酸鋁-乙酸鉀作顯色劑測定黃酮含量(此方法為國標(biāo)方法)(方法二)

分別吸取經(jīng)1.2.2.處理好的待測樣品溶液2，1.0 mL，各5份，按國標(biāo)GB/T20574-2006方法測定吸光度分別計(jì)算其中總黃酮的含量。吸光值和計(jì)算結(jié)果如下表7所示。

表7 某品牌蜂膠中總黃酮含量

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 同一品牌同一批次的蜂膠膠囊分別用兩種方法測總黃酮含量

分別用兩種方法測定同一批次中蜂膠中總黃酮的含量，每種方法取8份樣品，每份樣品0.40 g，結(jié)果見表8:

表8 兩種方法(不同顯色體系)測定蜂膠中總黃酮的含量

根據(jù)上表數(shù)據(jù)，經(jīng)T檢驗(yàn)計(jì)算判斷，樣本中t=1.454，小于t(0.05/7)=2.365，所以，以0.05為顯著性水平，當(dāng)df=7時(shí)，兩種測定方法差異不顯著。

2.2 討論

本文建立一種新的測定蜂膠制品中總黃酮的方法，用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑，以蘆丁為對(duì)照品，用分光光度法測定蜂膠中總黃酮的含量?；貧w方程是Y=1.244 4X+0.001 5，r2=0.999 9，方法的檢出限為1.25 mg，加標(biāo)回收率為97.30%～101.15%。

針對(duì)蜂膠膠囊樣品的幾個(gè)特殊性:一是蜂膠膠囊內(nèi)容物中自有的黑褐色容易影響測定結(jié)果;二是溶于95%乙醇溶液后水浴加熱會(huì)變成膠狀物質(zhì)，用濾紙過濾慢且容易損失;三是由于膠囊中含有大量的油脂成分，與水互不相溶，致使溶液渾濁影響測定結(jié)果。本方法采用了聚酰胺吸附及真空泵抽濾的方法，避免了測定結(jié)果的不準(zhǔn)確且有效提高測定速度。

用2種不同顯色體系對(duì)同一樣品，測得的總黃酮含量基本一致，經(jīng)過T檢驗(yàn)分析表明，以硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色體系測定方法和國標(biāo)GB/T20574-2006方法沒有顯著性差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，該方法準(zhǔn)確度和精密度較高，穩(wěn)定性好，更適用于蜂膠膠囊等脂溶性樣品中總黃酮的測定。

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