毛紹名，章懷云

丙酮丁醇梭菌高耐丁醇突變株的選育及其生理特性的研究

毛紹名，章懷云

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

丁醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的積累所產(chǎn)生的毒性問題是限制丁醇產(chǎn)量的重要因素，然而對(duì)于如何提高丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum丁醇耐受性，目前尚缺乏有效的方法。利用紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)獲得了一株丁醇的耐受性提高了46%的丙酮丁醇梭菌突變株M6，通過比較野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6在不同丁醇脅迫條件下的生理特性，發(fā)現(xiàn)突變株M6比野生型菌株具有更好的抵抗丁醇脅迫能力；進(jìn)行控制pH的分批發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，突變株M6的溶劑總產(chǎn)量提高了21.3%，其中丁醇和丙酮的產(chǎn)量分別提高了30.4%和8.3%。表明能夠通過紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)將C. acetobutylicum高耐受丁醇和高產(chǎn)丁醇的性能集中于同一菌株，這為選育既耐受較高濃度的丁醇又高產(chǎn)丁醇的工業(yè)化C. acetobutylicum菌株奠定了基礎(chǔ)。

丙酮丁醇梭菌；丁醇；突變株；丁醇耐受性

進(jìn)入21世紀(jì)后，石油資源緊缺而導(dǎo)致的石油價(jià)格持續(xù)上漲已成為不可逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。隨著石油資源的耗竭和溫室效應(yīng)等環(huán)境問題的日益突出，高效利用可再生原料生產(chǎn)能源和化學(xué)品已成為全球關(guān)注的重點(diǎn)之一。醇類是一類重要的平臺(tái)化學(xué)品，其中大部分醇可以通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化，因此醇類被認(rèn)為是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锶剂虾蜕锘瘜W(xué)品[1]。

丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑或用作溶劑、萃取劑等，丁醇又是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜕锶剂?，其熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)；含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會(huì)腐蝕管道、不易吸水，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合[2]。所以，丁醇已成為被世界各國企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)強(qiáng)烈關(guān)注的一種極具潛力的新型生物燃料。

發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇曾經(jīng)是僅次于乙醇的全球第二大發(fā)酵工業(yè)。隨著石油價(jià)格的不斷上漲，丁醇發(fā)酵工業(yè)已迎來復(fù)蘇產(chǎn)業(yè)的大好時(shí)機(jī)。目前，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇面臨的問題是發(fā)酵后期高濃度丁醇對(duì)細(xì)胞的毒性，丁醇毒性是其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)所面臨的最關(guān)鍵的問題，提高丁醇耐受性將極大的提高丁醇產(chǎn)量[3-5]。以前已經(jīng)有利用傳統(tǒng)技術(shù)和目標(biāo)代謝工程技術(shù)來提高丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum醇耐受性的報(bào)道。如：研究者通過在15-18g/L丁醇條件下馴化培養(yǎng)，篩選到了兩株丁醇耐受突變菌C. acetobutylicum SA-1[6]和G1[7]。在C. acetobutylicum中過表達(dá)表達(dá)熱激蛋白groESL操縱子顯著能增強(qiáng)宿主的丁醇產(chǎn)量和耐受性[8-9]。另外，在C. acetobutylicum ATCC 824中過表達(dá)spo0A基因能增強(qiáng)C. acetobutylicum丁醇耐受性并且在丁醇脅迫條件下能延長細(xì)胞代謝[10]。Zhu, L.等利用代謝工程技術(shù)在C.acetobutylicum DSM 1731中表達(dá)谷胱甘肽合成酶基因gshAB引入谷胱甘肽合成系統(tǒng)，能顯著提高菌株的丁醇耐受性和產(chǎn)量[11]。

本研究利用紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)C.acetobutylicum DSM 1731進(jìn)行誘變，并篩選出高耐受丁醇的突變株，獲得了一株丁醇的耐受性和丁醇產(chǎn)量顯著性提高的突變菌株M6，通過比較野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6在不同丁醇脅迫條件下的生理特性，并通過控制pH的分批發(fā)酵對(duì)野生型菌株和突變株進(jìn)行了代謝流的分析，從而對(duì)突變株M6丁醇耐受性及發(fā)酵特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過研究突變菌株生理代謝特性，對(duì)該菌株的丁醇耐受能力和丁醇生產(chǎn)能力進(jìn)行探討，為選育既耐受較高濃度的丁醇又高產(chǎn)丁醇的工業(yè)化菌株提供新的思路，為以后利用可再生資源生產(chǎn)化工原料丁醇及開發(fā)燃料丁醇奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種：C. acetobutylicum DSM 1731購自德國DSMZ菌種保存中心。

培養(yǎng)基：Reinforced clostridial medium (RCM)[12],Clostridial growth medium (CGM)[13]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化

用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈裝有C.acetobutylicum DSM 1731菌種的安瓿管，用火焰將安瓿管頂端加熱，再滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，接著吸取0.3～0.4 mL無菌的液體RCM培養(yǎng)基[12]滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。取約0.2 mL菌體懸浮液，移植于固體的RCM培養(yǎng)基[12]平板上，并在厭氧培養(yǎng)操作系統(tǒng)BACTRONⅡ-2中37℃厭氧培養(yǎng)；剩余的菌液加入至10 mL液體RCM培養(yǎng)基[12]中，并在75℃水浴中熱激10 mim，然后37℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.2 紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變選育高耐丁醇突變株

使用紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)選育高耐受丁醇的突變株M6。首先將C. acetobutylicum DSM 1 731種子接種到50 mL液體RCM培養(yǎng)基中[12]，并在75℃水浴中熱激10 min，然后37℃厭氧培養(yǎng)12 h；當(dāng)菌體生長至OD600= 2.0時(shí)，3 000×g離心10 min收集菌體；然后將菌體重懸至含有0.1 mol的磷酸鉀緩沖液 (pH7.0) 中；取菌體稀釋液加入至無菌的培養(yǎng)皿中，將加有菌懸液的培養(yǎng)皿放置于30W的紫外燈（事先預(yù)熱30 min）下，距離20 cm處進(jìn)行照射誘變。取不同誘變時(shí)間（60 、90、120、150和180 s）的處理液，將紫外誘變后菌液稀釋涂布于不同濃度的氯化鋰（氯化鋰濃度是4 、8 、12和16 g/L）固體RCM培養(yǎng)基 (RCM+ 2%瓊脂) 平板上，黑暗避光37℃厭氧培養(yǎng)。用無菌的0.1 mol的磷酸鉀緩沖液 (pH7.0)將誘變后固體RCM培養(yǎng)基平板上長出來的菌落洗下來，收集菌體懸液；將菌體懸液均勻涂布到不同濃度的丁醇固體RCM培養(yǎng)基 (RCM + 2%瓊脂) 平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；對(duì)不同濃度的丁醇固體RCM培養(yǎng)基平板上長出來的突變菌株進(jìn)行丁醇耐受性和產(chǎn)量的檢測(cè)；最終篩成功選到了一株能在19 g/L丁醇平板上生長的并且丁醇產(chǎn)量提高生物突變株M6。

1.2.3 C. acetobutylicum DSM 1731及其高突變株的丁醇耐受性比較

在平板上挑取C. acetobutylicum DSM 1731及其突變株M6單克隆接種分別到10 mL液體RCM培養(yǎng)基[12]中，并在75℃水浴中熱激10 min，然后37℃厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長至OD600=0.8時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)接至400 mL液體CGM[13]培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長至指數(shù)生長期OD600=1.0±0.05時(shí) (大約 12 h)；培養(yǎng)物被均分成4等份 (100 mL/份)，分別用0、6、12和18 g/L丁醇進(jìn)行脅迫處理；對(duì)C. acetobutylicum DSM 1731和M6在不同丁醇濃度脅迫下的生長狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.2.4 C. acetobutylicum DSM 1731及其高突變株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

大規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在BioFlo 110 發(fā)酵罐 (NBS公司) 中進(jìn)行。首先在平板上挑取C. acetobutylicum DSM 1731及其突變株M6單克隆分別接種到10 mL液體RCM培養(yǎng)基[12]中，并在75℃水浴中熱激10分鐘，然后37℃厭氧培養(yǎng)；當(dāng)菌體生長至OD600= 0.8時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)接至液體CGM[13]培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)作為種子液；當(dāng)種子液菌體生長至OD600= 0.2時(shí)，按5%的接種量接種到含有4 L液體CGM (80 g/L葡萄糖) 培養(yǎng)基的BioFlo 110發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；通過充氮?dú)?(流速50 mL/min) 維持發(fā)酵罐中厭氧環(huán)境；發(fā)酵起始pH大約是6.5，通過補(bǔ)加6 mol 氨水來控制菌體發(fā)酵pH維持在5.0。

1.2.5 發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

C. acetobutylicum DSM 1731及其突變株M6發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物（乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等）使用高效液相色譜 (High performance Liquid Chromatography, HPLC) 分離鑒定。首先將發(fā)酵過程中取出的樣品10 000×g離心5 min，取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES（SLGP033RB）0.22 μm針頭式過濾器過濾；過濾后的上清液全自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)入Agilent 1 200 HPLC(Agilent Technologies公司) 系統(tǒng)，用0.05 mmol稀H2SO4作為流動(dòng)性，流速0.50 mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H 離子交換柱 (7.8×300 mm，Bio-Rad公司)，柱溫控制在15℃，在30℃使用示差折光檢測(cè)器 (Refractive index (RI) detector) 進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)選育高耐受丁醇的突變株

本研究采用物紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)Clostridium acetobutylicum DSM 1731進(jìn)行誘變，并在含不同濃度丁醇的固體RCM培養(yǎng)基上進(jìn)行突變株的篩選，得到一株能在19 g/L丁醇的固體RCM培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長的突變株M6，該突變株相對(duì)于原始菌株DSM 1731，其丁醇耐受性提高了46%。因此有必要將突變株M6進(jìn)行下一步的生理特性的研究分析。

2.2 C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6的丁醇耐受性比較

將生長到指數(shù)生長期 (OD600= 1.0±0.05) 的野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6細(xì)胞在6 g/L，12 g/L，18 g/L丁醇中進(jìn)行脅迫處理，并監(jiān)測(cè)其生長曲線 (圖 1)。從圖中生長曲線我們能看出野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6在沒有丁醇脅迫環(huán)境下生長沒有顯著性差異 (圖 1A)。野生型菌株C.acetobutylicum DSM 1731能在6 g/L和12 g/L丁醇中生長，然而，對(duì)比突變株M6，野生型菌株DSM 1731的生長受到丁醇強(qiáng)烈抑制（圖 2B和2C）。突變株M6能在12 g/L和18 g/L丁醇中生長的比較穩(wěn)定，但是生長也受到了部分抑制（圖2C和2D）。野生型菌株DSM 1731完全不能在18 g/L丁醇中生長，生長被完全抑制；在后期DSM 1731開始死亡，而突變株M6的生長比較穩(wěn)定。這些結(jié)果清晰地展示出突變株M6在丁醇脅迫下具有更優(yōu)的生長表現(xiàn)，能夠耐受更高濃度的丁醇，具有更好的丁醇耐受性特征。

2.3 C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6發(fā)酵特性

為了獲得突變株M6更多的生理學(xué)特征，在BioFlo 110 發(fā)酵罐 (NBS公司) 中進(jìn)行控制pH (pH＜5.0) 分批發(fā)酵C. acetobutylicum DSM 1731和突變株M6實(shí)驗(yàn)。分別進(jìn)行了兩次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)取平均作為最終結(jié)果，發(fā)酵結(jié)果見圖 2。突變株M6在發(fā)酵過程中丁醇的最高產(chǎn)量達(dá)到16.01 g/L，相對(duì)于野生型DSM 1731丁醇的產(chǎn)量提高了30.4% (圖2A和圖 2 B)；M6在發(fā)酵過程中丙酮的最高產(chǎn)量是3.51 g/L，相對(duì)于野生型菌株丙酮的產(chǎn)量提高了8.3% (圖 2A和圖 2B)；M6在發(fā)酵過程中乙醇的最高產(chǎn)量是1.45 g/L，相對(duì)于野生型菌株丙酮的產(chǎn)量下降了16.2% (圖 2A和圖 2B)；其中M6的溶劑總產(chǎn)量達(dá)到20.84 g/L，相對(duì)于野生型菌株提高了21.3%。突變株M6的丁酸最高產(chǎn)量達(dá)到5.87 g/L高于野生型菌株DSM 1731的3.1 g/L。野生型菌株DSM 1731快速利用葡萄糖導(dǎo)致其在接種后24 h后迅速產(chǎn)生代謝物 (圖 2A和2C)。然而，突變株M6直到接種后30 h才開始產(chǎn)生代謝物 (圖 2B)。突變株M6丁醇平均產(chǎn)率最高達(dá)到22.7%，比野生型菌株DSM 1731丁醇平均產(chǎn)率提高了35.4%(圖2D)。突變株M6丁醇的產(chǎn)量提高了30.4%，這可能是由于在控制pH的分批發(fā)酵中，野生型菌株DSM 1731只產(chǎn)生了3.1 g/L丁酸，而M6產(chǎn)生了5.87 g/L丁酸，在突變株M6中過多的丁酸在發(fā)酵后期被迅速轉(zhuǎn)化成丁醇從而導(dǎo)致大量的丁醇積累，從圖 2B中可以看出在54 h，突變株合成丁醇量達(dá)到最高值，同時(shí)丁酸的產(chǎn)量也達(dá)到一個(gè)低值0.67 g/L。

圖1 野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731（空心正方形）和突變株M6 （實(shí)心正方形）在不同濃度丁醇下的生長曲線(A)：0 g/L丁醇；(B)：6 g/L丁醇；(C)：12 g/L丁醇；(D)：18 g/L丁醇Fig. 1 Growth profiles of the wild type strain DSM 1731 (open squares) and the mutant M6 (solid squares) challenged with different concentration of butanol

圖2 野生型菌株C. acetobutylicum DSM 1731 (A)和突變株M6 (B) 分批發(fā)酵曲線 (pH＜5.0)(C)：葡萄糖的利用曲線；(D)丁醇平均產(chǎn)率曲線；DSM 1731 (空心圓) 和M6 (實(shí)心圓)Fig. 2 Time-courses of the batch fermentations (pH ＞ 5.0) of (A) the wild type strain DSM 1731 and (B) the mutant M6

3 討 論

紫外線是一種使用最早、延用最久、效果明顯的物理誘變劑。紫外線誘變頻率高，操作簡單、而且不易回復(fù)突變。氯化鋰是一種堿金屬鹵化劑，其本身無誘變作用，但在誘變育種中表現(xiàn)出與一些誘變因子例如紫外線具有協(xié)同效應(yīng)，氯化鋰在一定濃度范圍內(nèi)，有利于菌體正突變的發(fā)生[14]。誘變劑的復(fù)合處理有一定的協(xié)同誘變效應(yīng)，能增強(qiáng)誘變效果，其突變率普遍比單獨(dú)處理的高，這對(duì)微生物育種具有重要的意義。

以前已經(jīng)有很多利用傳統(tǒng)技術(shù) (如：自然馴化，誘變育種) 來提高C. acetobutylicum丁醇耐受性的報(bào)道。如：研究者通過在15-18g/L丁醇條件下馴化培養(yǎng)，篩選到了兩株丁醇耐受突變菌C.acetobutylicum SA-1[6]和G1[7]。Baer等通過經(jīng)典的化學(xué)誘變C. acetobutylicum ATCC 824獲得一株丁醇耐受菌株C. acetobutylicum SA-2能在18g/L丁醇中生長，然而SA-2只能產(chǎn)生痕量的丁醇[15]。這些結(jié)果暗示提高丁醇的耐受性并不能相應(yīng)的提高菌株的丁醇產(chǎn)量。Formanek等[10]利用化學(xué)誘變技術(shù)篩選到一株能產(chǎn)生19 g/L丁醇的拜氏梭菌C. beijerinckii strain BA101。 在 C. acetobutylicum ATCC 824中過表達(dá)spo0A基因能增強(qiáng)宿主對(duì)丁醇的耐受性并延長代謝[10]。研究者還通過失活A(yù)TCC 824菌中的buk（丁酸激酶基因）能產(chǎn)生16.7 g/L丁醇[16]。此外，在失活solR基因的C.acetobutylicum ATCC 824菌中增強(qiáng)adhE1基因的表達(dá)能提高丁醇的產(chǎn)量 (17.6 g/L)[17]。本研究所獲得的突變株不但丁醇的耐受性提高了46%，而且丁醇的產(chǎn)量也提高了30.4%。

本研究將紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)應(yīng)用到工業(yè)梭菌遺傳育種中。證明了能夠通過紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)將C. acetobutylicum高耐受丁醇和高產(chǎn)丁醇的性能集中于同一菌株。這為選育既耐受較高濃度的丁醇又高產(chǎn)丁醇的工業(yè)化C.acetobutylicum菌株提供新的思路，為以后利用可再生資源生產(chǎn)化工原料丁醇及開發(fā)燃料丁醇奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

丁醇毒性是ABE（Acetone-butanol-ethanol）發(fā)酵中丁醇產(chǎn)量的限制性因素，研究表明提高細(xì)胞對(duì)丁醇的抗性會(huì)提高丁醇產(chǎn)量[3-5]。本研究通過紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)獲得了一株丁醇耐受性提高了46%的C. acetobutylicum 突變株M6。并對(duì)C. acetobutylicum DSM 1731及其突變株M6在不同丁醇濃度下進(jìn)行耐受性比較研究，結(jié)果顯示突變株M6具有更好的丁醇耐受性特征，其丁醇耐受性提高了46%。最后，通過控制pH的發(fā)酵來研究突變株M6和野生型菌株DSM 1731的生理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)突變株M6的溶劑總產(chǎn)量提高了21.3%，其中丁醇和丙酮的產(chǎn)量分別提高了30.4%和8.3%。

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Study on screening the butanol-tolerant mutant of Clostridium acetobutylicum and its physiological characteristics

MAO Shao-ming, ZHANG Huai-yun
(Hunan Province Key Lab. of Forestry Biotechnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Butanol toxicity is the major barrier for cost-effective fermentative production of butanol. Currently, there is no effective method to raise the butanol tolerance of C. acetobutylicum. UV Ray and Lithium Chloride were used to generate a strain of C.acetobutylicum mutant M6 which made butanol tolerance enhance by 46%. The comparative physiological analysis was carried out between C. acetobutylicum DSM 1731 and its mutant M6 with different butanol stress, and it was found that M6 had a higher butanol tolerance that the former. By batch fermentation experiments with pH control, and it was found that the solvent, butanol and acetone production of mutant M6 increased by 21.3%, 30.4% and 8.3% as compared to the wild type strain DSM 1731, respectively. The results indicate that UV Ray and Lithium Chloride composite mutation can accumulate the higher butanol tolerance of C. acetobutylicum, and improve butanol production. The data will be useful for further breeding the higher butanol tolerance and butanol production of industrial strain.

Clostridium acetobutylicum; butanol; mutant strain; butanol tolerance

S785；S798；Q936

A

1673-923X (2012)08-0103-05

2012-03-28

國家自然科學(xué)基金（31140014）;中南林業(yè)科技大學(xué)引進(jìn)高層次人才科研啟動(dòng)基金（104-1068）;中南林業(yè)科技大學(xué)校青年基金（QJ2011003A）

毛紹名（1982—），男，湖南懷化人，博士，講師；研究方向：林業(yè)生物技術(shù)；E-mail: msm526@163.com

章懷云（1951—），教授,研究方向：生物技術(shù)； 電話: 0731-85623479; E-mail: huaiyunzhang@126.com

[本文編校：邱德勇]