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      β結(jié)合素與大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制

      2014-08-18 11:34:10李上海梁偉鈞張亞娟吳鏗
      心腦血管病防治 2014年3期
      關(guān)鍵詞:氯化鋰心肌缺血凋亡

      李上海+梁偉鈞+張亞娟+吳鏗

      [摘要]目的研究大鼠心肌缺血、缺血再灌注、無創(chuàng)性缺血預(yù)處理以及氯化鋰干預(yù)后心肌細(xì)胞β結(jié)合素的陽性表達(dá)率及細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化,以探討β結(jié)合素與心肌缺血、缺血再灌注的關(guān)系以及可能機(jī)制。方法將入選的60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(C)、缺血組(I)、缺血再灌注組(IR)、氯化鋰藥物預(yù)處理組(PPC)。以TUNEL方法評估各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況,以免疫組化方法測定各組大鼠心肌細(xì)胞中β結(jié)合素的表達(dá),并計算各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及β結(jié)合素。結(jié)果與C組比較,I、IR、PPC四組凋亡指數(shù)均升高(P<0.05),各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較的結(jié)果為:IR組>I組>PPC組>C組(各組兩兩比較均P<0.05);各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。β_cat陽性表達(dá)率與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān),R=-0.90。結(jié)論β_cat陽性表達(dá)率與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān),提示β_cat可以減少心肌缺血、缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡。

      [關(guān)鍵詞]心肌缺血;心肌再灌注損傷;凋亡;β結(jié)合素;氯化鋰

      缺血性心臟病(IHD)是由多種病因?qū)е碌墓跔顒用}血流量不足、心肌缺血缺氧,從而引起心肌功能障礙和器質(zhì)性病變。近年來,在心肌梗死后及時實施血運(yùn)重建(包括靜脈溶栓技術(shù)、動脈搭橋術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)等)是治療心肌梗死的最佳措施,挽救了大量患者的生命,但是血液復(fù)流后部分缺血的心肌組織代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞反而更加嚴(yán)重,這種現(xiàn)象被稱為心肌再灌注損傷(Myocardial Reperfusion Injury, MRI)[1]。MRI反常的抵消了開通血管的有益作用,甚至帶來致死性的損傷。目前的研究應(yīng)用證明抗氧化劑、鈣通道阻滯劑、ACEI等對減少M(fèi)RI后心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌梗死后心功能等方面起到了重要作用,但效果并沒有達(dá)到理想水平,相關(guān)藥物仍在不斷研發(fā)中。無機(jī)離子鋰臨床上用來治療躁狂和抑郁癥。Klein和Melton于1996年首次報道了鋰離子可選擇性抑制糖原合成酶激酶_3β(GSK_3β)[2],目前鋰離子已作為一種非常有用的工具用于對GSK_3β廣泛的生物學(xué)功能的研究,通過鋰的作用來研究抑制GSK_3β后細(xì)胞功能的改變[3],GSK_3β及β結(jié)合素(β_catenin,β_cat)均是參與Wnt信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵介質(zhì)[4]。本實驗擬通過應(yīng)用氯化鋰抑制GSK_3β對β_cat的磷酸化,使細(xì)胞內(nèi)β_cat含量增加,從而觀察β_cat變化含量與MRI的關(guān)系。

      1資料與方法

      1.1實驗動物:由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供健康雄性SPF級SD大鼠60只,2月齡,體重(200±20)克。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(C)、缺血組(I)、缺血再灌注組(IR)、氯化鋰藥物預(yù)處理組(PPC),共四組,每組15只。

      1.2大鼠模型的制備:將大鼠禁食12h后,稱重,用烏拉坦腹腔注射麻醉(每100g體重大鼠用量為125mg)大鼠固定于手術(shù)臺。用銀針電極插入大鼠四肢皮下,接上心電圖機(jī)。心電圖定標(biāo)為2mv,檢測肢體二導(dǎo)聯(lián)。頸部切開皮膚,用玻璃分針鈍性分離皮下肌肉,暴露氣管,用眼科剪將氣管剪成T型開口,與動物呼吸機(jī)相連,調(diào)節(jié)呼吸機(jī)參數(shù)為:潮氣量2~3ml/100g,頻率60次/分,吸呼比1∶2。術(shù)中注意觀察氣管插管是否通暢以及肺的膨脹情況。在胸骨左緣約1cm處剪開皮膚,鈍性分離肌層,剪斷3、4肋骨,用擴(kuò)胸器撐開肋骨,充分暴露術(shù)野。剪開心包,用帶5/0線的圓針在肺動脈圓錐和左心耳之間進(jìn)針。C組只在左前降支埋線1h,不結(jié)扎冠狀動脈。I組結(jié)扎前降支1h。IR組先結(jié)扎前降支1h,然后松扎3h。PPC組先頸靜脈注射氯化鋰(劑量為15mg/kg),然后結(jié)扎左前降支1h,再灌注3h。

      1.3采集標(biāo)本:模型制備成功后,取心尖缺血最明顯部位組織,切取小塊的心肌組織,立即置于4%多聚甲醛中固定。24h后,流水沖洗2h,先后以濃度為70%,80%,90%,95%,100%的乙醇脫水,每種濃度酒精的脫水時間均為2h,二甲苯透明30min。浸蠟,包埋。每個標(biāo)本的心肌組織都行4mm連續(xù)切片8張,在載玻片上鋪有一薄層多聚賴氨酸,切片貼于載玻片上。60℃烘烤4h,將石蠟切片放4℃下保存待測。

      1.4實驗室檢測:轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),以免疫組化法檢測心肌細(xì)胞中β_cat的表達(dá)。

      1.5統(tǒng)計學(xué)處理:所有實驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0軟件包處理,經(jīng)D檢驗,顯示數(shù)據(jù)成正態(tài)分布,故實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)。各組樣本均數(shù)的兩兩比較采用完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2實驗結(jié)果

      C組有1只大鼠因誤剪動脈大出血死亡,I組有2只因結(jié)扎冠狀動脈后室顫死亡,IR組有2只因再灌注心律失常死亡,1只未發(fā)現(xiàn)再灌注退出實驗,PPC有1只因頸靜脈注射時撕裂頸靜脈出血較多死亡。共用實驗動物60只,最終獲得53只大鼠的完整資料。

      2.1形態(tài)學(xué)觀察:在高倍顯微鏡下(20×20)觀察經(jīng)TUNEL技術(shù)處理過的心肌組織切片,正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈淡藍(lán)色,凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核被染成深淺不一的棕褐色。假手術(shù)對照組大多數(shù)細(xì)胞核呈藍(lán)色,極少數(shù)被染成棕褐色;IR組切片大量細(xì)胞核深染;PPC組也可見部分細(xì)胞核染成棕褐色,其數(shù)量較C組多但較IR組少。

      在高倍顯微鏡下(20×20)觀察經(jīng)免疫組化處理過的心肌組織切片,陽性表達(dá)β_cat的細(xì)胞表現(xiàn)為:心肌閏盤處有與心肌纖維垂直的棕褐色條帶,細(xì)胞漿被染成棕褐色,少數(shù)細(xì)胞核被染成棕褐色,細(xì)胞核被染成棕褐色細(xì)胞為β_cat陽性表達(dá)細(xì)胞。在PPC組可見大量β_cat陽性表達(dá)信號,而其余三組相對較少(見圖5~8)。圖1C組心肌細(xì)胞TUNEL觀察(20×20)圖2I組心肌細(xì)胞TUNEL觀察(20×20)圖3IR組心肌細(xì)胞TUNEL觀察(20×20)圖4PPC組心肌細(xì)胞TUNEL觀察(20×20)圖5C組大鼠β_cat觀察(20×20)圖6I組大鼠β_cat觀察(20×20)圖7IR組大鼠β_cat觀察(20×20)圖8PPC組大鼠β_cat觀察(20×20)

      2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較:.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低(2.0±0.12),I組明顯增加(5.50±1.11),IR組進(jìn)一步增加(22.21±2.31),為各組最高,PPC組較IR組減少(4.35±1.57),但仍較C組高。與C組比較,I、IR組β_cat的含量均降低(P<0.05),而PPC組明顯升高(P<0.05),各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。

      3討論

      IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病,以往對其研究主要著重于改善血供,減緩缺血區(qū)心室重構(gòu),進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動脈再通后心功能的重要因素?,F(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭,甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控,其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因,包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時,Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax,抑制凋亡的發(fā)生[6]。

      β_cat是一種多功能蛋白質(zhì),是Wnt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì),能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù),其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號刺激后可啟動或抑制下游靶基因的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來,β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7,8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少,本實驗結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡,減輕心肌缺血再灌注損傷,可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá),提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

      無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報道[9,10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽,能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋,只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實驗應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合,成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集,同時亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá),而其余各組(圖5~8)僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說,本實驗通過氯化鋰的作用,干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用,進(jìn)一步干擾了Wnt信號通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見,PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多;各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組,符合既往的研究成果,從側(cè)面反映了本研究的可靠性;C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高,結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多,從實驗推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少,但實驗結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高,考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

      基于前人的研究成果,再結(jié)合本實驗的研究結(jié)果,我們認(rèn)為:β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色,β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān),β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用,其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實驗初步證實了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡,對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路,對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

      參考文獻(xiàn)

      [1]陳主初,郭恒怡,王樹人.病理生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:190-202.

      [2]Klein PS, Melton DA.A molecular mechanism for the effect of lithium on development[J]. Proc Natl Acad Sci,1996,93(16):8455-8459.

      [3]Pandey GN, Ren X, Rizavi HS, et al.Glycogen synthase kinase_3beta in the platelets of patients with mood disorders: effect of treatment[J]. Psychiatr Res,2010,44(3):143-148.

      [4]Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, beta_catenin, and cadherin pathways[J]. Science,2004,303(5663):1483-1487.

      [5]Brown R. The Bcl_2 family of proteins[J]. Br Med Bull,1997,53(3):466-477.

      [6]Mackey TJ, Borkowski A, Amin P, et al. bcl_2/bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with prostate cancer[J]. Urology,1998,52(6):1085-1090.

      [7]Brade T, Mnner J, Kühl M. The role of Wnt signalling in cardiac development and tissue remodelling in the mature heart[J]. Cardiovasc Res,2006,72(2):198-209.

      [8]Baurand A, Zelarayan L, Betney R, et al. β_Catenin Downregulation Is Required for Adaptive Cardiac Remodeling[J]. Circ Res,2007,100(9):1353-1362.

      [9] Xu CM, Wang J, Wu P, et al. Glycogen synthase kinase_3β in the nucleus accumbens core mediates cocaine_induced behavioral sensitization[J]. Neurochem,2009,111(6):1357-1368.

      [10]Park HJ, Kim HJ, Bae GS, et al. Selective GSK_3β inhibitors attenuate the cisplatin_induced cytotoxicity of auditory cells[J].Hear Res,2009,257(1-2):53-62.

      2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較:.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低(2.0±0.12),I組明顯增加(5.50±1.11),IR組進(jìn)一步增加(22.21±2.31),為各組最高,PPC組較IR組減少(4.35±1.57),但仍較C組高。與C組比較,I、IR組β_cat的含量均降低(P<0.05),而PPC組明顯升高(P<0.05),各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。

      3討論

      IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病,以往對其研究主要著重于改善血供,減緩缺血區(qū)心室重構(gòu),進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動脈再通后心功能的重要因素?,F(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭,甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控,其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因,包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時,Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax,抑制凋亡的發(fā)生[6]。

      β_cat是一種多功能蛋白質(zhì),是Wnt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì),能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù),其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號刺激后可啟動或抑制下游靶基因的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來,β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7,8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少,本實驗結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡,減輕心肌缺血再灌注損傷,可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá),提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

      無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報道[9,10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽,能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋,只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實驗應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合,成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集,同時亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá),而其余各組(圖5~8)僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說,本實驗通過氯化鋰的作用,干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用,進(jìn)一步干擾了Wnt信號通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見,PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多;各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組,符合既往的研究成果,從側(cè)面反映了本研究的可靠性;C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高,結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多,從實驗推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少,但實驗結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高,考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

      基于前人的研究成果,再結(jié)合本實驗的研究結(jié)果,我們認(rèn)為:β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色,β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān),β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用,其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實驗初步證實了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡,對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路,對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

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      [4]Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, beta_catenin, and cadherin pathways[J]. Science,2004,303(5663):1483-1487.

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      [6]Mackey TJ, Borkowski A, Amin P, et al. bcl_2/bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with prostate cancer[J]. Urology,1998,52(6):1085-1090.

      [7]Brade T, Mnner J, Kühl M. The role of Wnt signalling in cardiac development and tissue remodelling in the mature heart[J]. Cardiovasc Res,2006,72(2):198-209.

      [8]Baurand A, Zelarayan L, Betney R, et al. β_Catenin Downregulation Is Required for Adaptive Cardiac Remodeling[J]. Circ Res,2007,100(9):1353-1362.

      [9] Xu CM, Wang J, Wu P, et al. Glycogen synthase kinase_3β in the nucleus accumbens core mediates cocaine_induced behavioral sensitization[J]. Neurochem,2009,111(6):1357-1368.

      [10]Park HJ, Kim HJ, Bae GS, et al. Selective GSK_3β inhibitors attenuate the cisplatin_induced cytotoxicity of auditory cells[J].Hear Res,2009,257(1-2):53-62.

      2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較:.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低(2.0±0.12),I組明顯增加(5.50±1.11),IR組進(jìn)一步增加(22.21±2.31),為各組最高,PPC組較IR組減少(4.35±1.57),但仍較C組高。與C組比較,I、IR組β_cat的含量均降低(P<0.05),而PPC組明顯升高(P<0.05),各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。

      3討論

      IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病,以往對其研究主要著重于改善血供,減緩缺血區(qū)心室重構(gòu),進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動脈再通后心功能的重要因素。現(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭,甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控,其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因,包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時,Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax,抑制凋亡的發(fā)生[6]。

      β_cat是一種多功能蛋白質(zhì),是Wnt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì),能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù),其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號刺激后可啟動或抑制下游靶基因的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來,β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7,8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少,本實驗結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡,減輕心肌缺血再灌注損傷,可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá),提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

      無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報道[9,10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽,能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋,只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實驗應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合,成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集,同時亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá),而其余各組(圖5~8)僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說,本實驗通過氯化鋰的作用,干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用,進(jìn)一步干擾了Wnt信號通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見,PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多;各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為:PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組,符合既往的研究成果,從側(cè)面反映了本研究的可靠性;C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高,結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多,從實驗推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少,但實驗結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高,考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

      基于前人的研究成果,再結(jié)合本實驗的研究結(jié)果,我們認(rèn)為:β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色,β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān),β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用,其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實驗初步證實了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡,對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路,對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

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