廖 婷 ，袁德義 ，彭邵鋒 ，鄒 鋒

油茶自交和異交過程花粉管生長的熒光顯微觀察

廖 婷1，袁德義1，彭邵鋒2，鄒 鋒1

(1.中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學研究院，湖南 長沙 410004)

以普通油茶‘華碩’為試材，運用熒光顯微觀察法，研究了其自交和異交授粉后花粉在花柱上萌發(fā)和花粉管生長變化情況。結(jié)果表明：自交和異交授粉后，花粉均能在柱頭上正常萌發(fā)，且花粉管均能生長到花柱基部，但生長速度不一樣，異交的生長速度略快于自交；自交授粉72 h后花粉管到達花柱基部，異交60 h到達花柱基部，自交192 h后花粉管到達胚囊；自交與異交授粉花粉管白天生長速度均顯著高于晚上。

油茶；自交；異交；花粉管；顯微觀察

油茶Camellia oleifera 屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia 植物，為常綠小喬木或灌木，是我國南方重要的木本食用油料樹種[1]。油茶在我國已有2 000多年的栽培歷史，主要分布在長江流域及其以南的14個?。ㄊ?、區(qū)），現(xiàn)有油茶面積約300 hm2，年產(chǎn)值近200億元，在我國經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)中占著十分重要的地位[2]。茶油色清味香，營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)保健食用油，深受廣大消費者喜愛，被譽為“東方橄欖油”[3]。

近年來，關于油茶的研究主要集中在育苗[4-5]、土肥水管理[6-7]、病蟲害防治以及良種選育等領域上，盡管在栽培技術上取得了一定的成果，然而油茶在實際生產(chǎn)中存在授粉受精不良的現(xiàn)象，表現(xiàn)為授粉后花粉管不能萌發(fā)和生長，從而導致油茶“座果率低、結(jié)實率低”的問題。對此，不少研究者從油茶花粉特性出發(fā)，對其花粉數(shù)量[8-9]、花粉形態(tài)特征[10-11]、花粉離體萌發(fā)[12]與貯藏[13-15]進行了大量研究，卻還不夠系統(tǒng)。油茶正常授粉后花粉在柱頭上萌發(fā)及花粉管在花柱、子房中生長的行為，是油茶受精座果的前提，并直接關系到油茶能否結(jié)實。所以，開展油茶自交和異交授粉后花粉管生長行為的研究，這對生產(chǎn)上進行油茶合理品種配置、提高其座果率和結(jié)實率等具有一定的實踐指導意義。

目前，有關山茶屬自花和異花授粉后花粉管生長行為有一些報道，如梁漢興等[16]觀察了金花茶花粉粒在野山茶柱頭上生長的行為，96 h到達其花柱的3/4處，120 h進入子房；楊志玲等[17]以長瓣短柱茶、浙江紅山茶為試材，研究了花粉管在柱頭及花柱中行為，發(fā)現(xiàn)花粉管在2/3花柱時伸長速度慢并形成胼胝質(zhì)；王郁等[18]觀察到茶樹品種龍井43自交花粉可以在柱頭上正常萌發(fā)并生長，授粉24 h內(nèi)自交與異交花粉管生長特性無明顯差異，而授粉后24 h自交花粉管生長速度明顯慢于異交。然而，關于油茶的自交和異交花粉管生長行為研究的相關報道較少[11,19-20]。因此，本試驗以大果油茶良種‘華碩’[21]為試材，從形態(tài)學的角度對其自交和異交花粉管的生長行為進行了熒光顯微觀察，以此了解‘華碩’自花和異花授粉時花粉管在花柱中的行為及其胼胝質(zhì)發(fā)生的位置，為今后油茶良種合理配置、高效栽培及雜交育種提供一些基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料均來自中南林業(yè)科技大學馬家河試驗基地油茶種質(zhì)資源收集圃?；匚挥诒本?8°06′03″，東經(jīng)111°56′30″，屬亞熱帶季風性濕潤氣候，四季分明，雨水充沛，日照充足，平均氣溫16～18℃，年平均降水量1 200 mm，平均日照1 600 h，無霜期285 d，為油茶的最適生長區(qū)域之一。供試材料為普通油茶‘華碩’（ 2009年通過國家林木品種審定），授粉品種為‘華鑫’（2009年通過國家林木品種審定），樹齡30 a，樹勢中等，均能正常開花結(jié)果。試驗地水肥條件良好，立地條件和管理措施完全一致。

1.2 方 法

1.2.1 花粉的采集

花粉采集按袁德義等[13]的方法，取大蕾期的花朵室內(nèi)催花，花粉貯藏于貼有標簽的小瓶中備用。

1.2.2 熒光顯微觀察法

在2010年11月上旬‘華碩’、‘華鑫’盛花期進行人工控制授粉，分別采集自花（‘華碩’ב華碩’）和異花（‘華碩’ב華鑫’）授粉后1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、144、168、192 h的雌蕊各10個（花柱和子房），用卡諾氏固定液（乙醇∶醋酸=3∶1）固定12 h后轉(zhuǎn)入70﹪乙醇中低溫保存?zhèn)溆?。參照鄒鋒[20]的方法稍作修改，用8 mol/L NaOH軟化4～5 h，蒸餾水沖洗后，在0.05﹪苯胺藍溶液(0.05﹪苯胺藍+0.15 mol磷酸氫二鉀)中染色4 h，材料常規(guī)壓片。在Olympus BX-51型熒光顯微鏡下觀察，分別觀測柱頭上花粉的萌發(fā)和花粉管在花柱內(nèi)的生長情況，并數(shù)碼拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用數(shù)碼測距軟件Digimizer Image Analysis V3.1.1.0測量花粉管在花柱中生長的長度，并用Office Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自交花粉管的行為

授粉的花柱經(jīng)染色后，‘華碩’花粉粒和花粉管在綠色熒光的激發(fā)下呈現(xiàn)強烈的藍綠色熒光，可以觀察到其花粉粒在柱頭上萌發(fā)和花粉管的生長情況。自花授粉后1 h，柱頭上沒有花粉萌發(fā)；授粉后2 h，柱頭上有部分花粉粒開始萌發(fā)，少數(shù)花粉管通過乳突細胞伸入柱頭（圖1，a）；授粉后24 h，大量花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管生長至花柱1/3處（圖1，b）；授粉后48 h，花粉管達花柱中部，沿花柱道向下生長（圖1，c）；授粉后60 h，花粉管長至花柱中下部；授粉后72 h，有部分花粉管開始到達花柱基部（圖1，d）；授粉后84 h，大量花粉管到達花柱基部（圖1，e）；授粉后96 h，可見花粉管開始穿過花柱基部（圖1，f）；授粉后120 h，花粉管在花柱基部和子房相連的組織中生長，到達子房上端（圖1，g）；授粉后192 h，花粉管到達胚囊（圖1，h）。

圖1 ‘華碩’自交花粉管的生長情況Fig. 1 Pollen tube growth of self-pollination in ‘Huashuo’

2.2 異交花粉管的行為

在異花授粉過程中，授粉后2 h，可見‘華碩’柱頭上部分‘華鑫’花粉粒萌發(fā)（圖2，a）；授粉后24 h，大量‘華鑫’花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管生長至‘華碩’花柱1/3處（圖2，b），與自交情況無明顯差異；授粉后36 h，花粉管已達其花柱中部（圖2，c）；授粉后48 h，花粉管長至其花柱中下部；授粉后60 h，可見部分花粉管開始到達花柱基部（圖2，d）；授粉后84 h，花粉管開始穿過花柱基部（圖2，e）；授粉后96 h，可見大量‘華鑫’花粉管穿過‘華碩’花柱基部（圖2，f）。

圖2 ‘華碩’異交花粉管的生長情況Fig. 2 Pollen tube growth of cross-pollination in ‘Huashuo’

2.3 自交與異交花粉管生長情況比較

自交和異交花粉管生長情況的比較見圖3。由圖3可知：‘華碩’自交和異交花粉管的生長速度不同，異交授粉生長速度比自交快。在整個生長過程中，自交花粉管于授粉后72 h生長至花柱基部，而異交花粉管則在授粉后60 h到達花柱基部。

圖3 自交與異交花粉管生長情況的比較Fig.3 Comparison of pollen tubes growth in self-pollination and cross pollination

‘華碩’自交和異交花粉管各時間段平均生長速度見圖4。由圖4可知，‘華碩’自交和異交花粉管不同時間段的平均生長速度具有較明顯的差異，且各時間段異花的花粉管均比自花花粉管生長速度快。授粉后0～2 h和2～8 h，自交和異交授粉花粉管均比其他時間段生長迅速，自交平均生長速度分別為 37.688 μm/h 和 44.735 μm/h，異交分別為43.174 μm/h 和 48.148 μm/h；授粉后 24 ～ 36 h 和48～60 h，花粉管生長相對較快；授粉后12～24 h和36～48 h，花粉管生長緩慢，自交授粉花粉管平均生長速度分別為9.343 μm/h和11.591 μm/h，異交分別為9.041 μm/h和19.841 μm/h。通過分析可知，整個過程中，自交授粉的平均生長速度為22.507 μm/h，異交授粉的平均生長速度為26.504 μm/h，兩者速度相差不大。但是油茶‘華碩’自交授粉花粉管白天生長速度為 30.73 μm/h，晚上僅為 14.283 μm/h，白天速度為夜晚的2.15倍；異交授粉花粉管白天生長速度為 34.546 μm/h，晚上為 14.441 μm/h，白天速度為晚上速度的2.39倍。

圖4 自交與異交花粉管各時間段平均生長速度的比較Fig.4 Comparison of average growth speed of self-pollination and cross pollination pollen tubes among each time periods

3 結(jié)論與討論

內(nèi)外因子對普通油茶‘華碩’花粉萌發(fā)和花粉管的生長有重要的影響。本實驗研究對油茶‘華碩’花粉萌發(fā)和花粉管生長的觀察表明，其自交和異交授粉花粉管均能生長到花柱基部，但生長速度不一樣，異交的平均生長速度（26.504 μm/h）大于自交（22.507 μm/h），并且自交授粉72 h后花粉管到達花柱基部，異交60 h到達花柱基部。這與何春燕[19]對油茶‘湘林1號’、鄒鋒[20]對攸縣油茶、李春林等[11]對油茶‘長林4號’授粉后花粉管生長速度和時間范圍的結(jié)果不一，產(chǎn)生這種差異的可能原因與物種遺傳特性、自身營養(yǎng)條件狀況等有著密切的關系[22]。隨著授粉后時間推移，油茶‘華碩’自交與異交花粉管的生長速度總體上來說呈下降趨勢，前期生長快，后期生長慢，且花粉管數(shù)量逐漸減少，這種現(xiàn)象與Suwan等[23]提出的“二核花粉管生長分為自養(yǎng)階段和異養(yǎng)階段，在自養(yǎng)和異養(yǎng)階段，花粉管生長較快，而在它們的過渡階段花粉管生長較慢”相一致，但是有關決定油茶花粉管生長速度的因子，如鈣與鈣調(diào)素等對花粉管有定向生長的調(diào)控作用，這還需要進一步研究。

外因主要是花期氣候環(huán)境條件影響花粉萌發(fā)[24]和花粉管生長行為[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘華碩’自花和異花授粉的花粉管白天的平均生長速度均比夜晚的生長速度快，可能原因是‘華碩’秋冬季節(jié)開花，且實驗基地位于鄉(xiāng)村，夜晚溫度明顯低于白天溫度，所以，花粉管晚上生長緩慢。這與范學翠等[26]對無籽八月橘的授粉后花粉管行為的研究結(jié)果類似，在陰天無風條件下異花授粉的花粉管生長速度比在晴天無風條件下自花授粉的速度慢。因此，溫度也是影響油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長的重要因子之一。

研究結(jié)果還表明，‘華鑫’花粉管在花柱和子房生長過程中并未發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積和胼胝質(zhì)塞出現(xiàn)的情況，由此說明‘華鑫’適宜做大果油茶良種‘華碩’的授粉樹，在生產(chǎn)上應配套栽植。

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A fluorescence microscope observation on self and cross-pollination of pollen tubes in Camellia oleifera

LIAO Ting1, YUAN De-yi1, PENG Shao-feng2, ZOU Feng1
(1.Key Lab. of Non-wood Forest Products of Forestry Ministry , Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry Science, Changsha 410004, Hunan, China)

Germination of pollens and growth of pollen tubes were observed in Camellia oleifera (‘huashuo’) after self and crosspollination by fluorescence microscope observation method. The results show that the pollens in self and cross-pollination germinated normally, and the pollen tubes could reach the style base, while the values of growth speed were different. The growth speed in crosspollination was slightly faster than that in self-pollination. The pollen tubes arrived at the style base in 72 hours after self-pollination,while it took 60 hours dealing with cross-pollination, and the pollen tubes entering into the embryo sac 192 hours after self-pollination;the study also revealed that the growth speed during the daytime was significantly higher than at nighttime between in the self-pollination and the cross-pollination pollen tubes.

Camellia oleifera; self-pollination; cross-pollination; pollen tubes；microscope observation

S794.4

A

1673-923X (2012)07-0034-04

2012-04-10

國家自然科學基金項目“油茶自交敗育機制研究”（31170639）

廖 婷（1989—），女，江西萍鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟林育種栽培研究;E-mail: liaoting19@163.com

袁德義（1967—），男，湖北隨州人，教授，博士，博士生導師，長期從事經(jīng)濟林栽培及育種研究;

E-mail: yuan-deyi@163.com

[本文編校：謝榮秀]