王雷宏，鄭玉紅，湯庚國

〔1.安徽農(nóng)業(yè)大學林學與園林學院，安徽 合肥 230036；2.江蘇省·中國科學院植物研究所（南京中山植物園），江蘇 南京 210014；3.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037〕

山荊子〔Malus baccata（L.）Borkh.〕是蘋果屬（Malus Mill.）脫萼組（Sect.Gymnomeles Koehne）種類中分布范圍最廣的一個種，集中分布于中國，為東亞分布型，是典型的多型性發(fā)達種［1］。山荊子生長速度快、易繁殖，與蘋果（M.pumila Mill.）嫁接后親和力強、耐寒性強，是東北、華北和西北山區(qū)蘋果嫁接的主要砧木材料；山荊子花、果美麗，果實、種子、嫩葉和木材等均具有很高的經(jīng)濟價值，是蘋果屬的珍貴野生植物資源［2］。有關該種形態(tài)變異、遺傳多樣性等方面的研究結果表明：山荊子居群間的遺傳分化和親緣關系較為復雜［3-6］。Nei［7］認為：物種表型進化是由相互作用的基因突變引起的，不同分類等級物種的表型多樣性是新突變和遺傳基因的累積產(chǎn)物，新突變基因通過自然選擇和基因漂變被納入基因組中并產(chǎn)生遺傳保守性，從而影響表型進化的方向；Rouzine等［8］通過對植物的病毒學實驗，認為：低多樣性居群受中性變異控制，高多樣性居群受自然選擇控制，不同物種的遺傳變異差異明顯。因此，探明山荊子的居群遺傳結構和遺傳分化規(guī)律及地理居群的多樣性是闡明其系統(tǒng)進化和演化的主要途徑，對山荊子的物種起源和遺傳進化研究具有重要意義。

作者采用SSR標記技術對山荊子主要分布區(qū)的8個居群140個單株的遺傳多樣性、居群遺傳結構以及居群間的親緣關系進行了分析，以期為該種的起源和地理演化規(guī)律研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取分布于黑龍江、吉林、河北、山西和北京等地的8個山荊子居群進行取樣，各居群的概況見表1。每個居群隨機選取20株以上生長狀況良好的植株作為樣株，總株數(shù)不足20株的居群則全部選為樣株，8個居群共計140個樣株。在樣株上采集健康的幼嫩葉片，用變色硅膠迅速干燥并帶回實驗室，常溫條件下保存、備用。

表1 供試的8個山荊子居群概況Table1 Status of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.tested

1.2 方法

參照Doyle等［9］的CTAB法提取葉片基因組總DNA。將獲得的DNA溶解于滅菌雙蒸水中，-20℃貯存、備用。根據(jù)文獻［10-12］確定30對引物進行擴增反應預實驗，通過預實驗篩選出擴增條帶豐富、信號強的10對引物用于SSR擴增反應。引物均由上海英駿生物工程技術有限公司合成。

采用PE-9700 PCR儀（美國GeneAmp公司）進行SSR-PCR擴增反應，PCR反應相關試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。反應體系總體積10μL，包含0.4μmol·L-1的d ATP、d GTP、d CTP和d TTP，1× Taq DNA聚合酶緩沖液（含有10 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1KCl和體積分數(shù)0.1％Trion X-100，pH8.4），2.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA，0.4μmol·L-1上下游引物，雙蒸水補足至10μL。擴增程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃～60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)反應；最后于72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物置于4℃冰箱中保存。

用質量體積分數(shù)10％的聚丙烯酰胺凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，采用50 bp Marker〔購自寶生物工程（大連）有限公司〕進行分子量標記，電壓240 V，電泳時間1 h。電泳結束后用銀染法染色，染色方法為：凝膠先用體積分數(shù)10％乙醇和體積分數(shù)0.5％冰乙酸混合溶液固定12 min，然后用質量體積分數(shù)0.2％ AgNO3水溶液處理12 min；水洗后用含質量體積分數(shù)1.5％NaOH、體積分數(shù)0.4％甲醛和質量體積分數(shù)0.02％Na2S2O3的混合液顯色5～10 min，至譜帶清晰為止。染色結束后，將凝膠用自來水沖洗干凈，用FR-200A凝膠成像系統(tǒng)（上海復日科技有限公司）觀察電泳結果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

人工判讀條帶，并應用POPGENE v1.31軟件［13］計算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和多態(tài)性條帶百分率；基于等位基因頻率，在假設遺傳平衡的條件下，計算居群間的基因分化系數(shù)（G st）和基因流（N m），并用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果和分析

2.1 SSR擴增結果分析

采用10對SSR引物對8個山荊子地理居群140個單株的基因組總DNA進行SSR擴增，引物的序列及擴增結果見表2。10對引物共擴增出91條帶，平均每對引物擴增出9.1條帶，多態(tài)性條帶百分率達100.00％。其中，引物CH02b12擴增出的條帶最多，達13條；引物U78949擴增出的條帶最少，僅4條。

表2 8個山荊子居群的SSR－PCR擴增結果Table2 Amplified results of SSR-PCR of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.

2.2 居群的遺傳多樣性分析

根據(jù)SSR標記分析結果得出的8個山荊子居群的遺傳參數(shù)見表3。由表3可知：吉林長白山山荊子居群的有效等位基因數(shù)最大，為1.5350；山西中條山山荊子居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)最高，分別為0.3092和0.4592；河北塞罕壩居群的有效等位基因數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)最低，分別為1.4379和0.2560；山西管涔山居群的Shannon信息指數(shù)最低，為0.3767。吉林長白山居群和山西中條山居群的多態(tài)性條帶最多，均為78條；山西五臺山居群的多態(tài)性條帶最少，僅59條。從居群的多態(tài)性條帶百分率來看，山西五臺山居群最低，為64.84％；吉林長白山居群和山西中條山居群最高，均為85.71％。

由表3還可以看出：供試的8個山荊子居群間的有效等位基因數(shù)為1.6169，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.3551，Shannon信息指數(shù)為0.5285，多態(tài)性條帶百分率達100.00％，居群間的各項遺傳多樣性指數(shù)均高于居群內(nèi)。

2.3 居群的聚類分析結果

基于Nei’s遺傳距離獲得的8個山荊子居群的UPGMA聚類結果見圖1。在Nei’s遺傳距離0.1486處，8個居群被分成3個大組：第1組包括山西五臺山居群和北京東靈山居群；第2組包括山西中條山居群、吉林長白山居群、黑龍江小興安嶺居群、山西靈空山居群和山西管涔山居群；第3組僅含河北塞罕壩1個居群。由圖1可見：發(fā)生明顯地理分化的是山西五臺山居群、北京東靈山居群、山西管涔山居群和河北塞罕壩居群；山西靈空山居群、黑龍江小興安嶺居群、吉林長白山居群和山西中條山居群可能是山荊子的多樣性核心居群。山西五臺山居群和北京東靈山居群的地理位置較近，遺傳關系也最近，而其他居群間的遺傳關系與地理位置沒有明顯的相關性。

表3 基于SSR標記分析的8個山荊子居群的遺傳多樣性分析結果Table3 Analysis results of genetic diversity of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.based on SSR marker analysis

圖1 基于SSR標記分析結果的8個山荊子居群的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.based on SSR marker analysis result

2.4 居群間的基因分化分析

對8個山荊子居群進行基因分化分析，居群間的基因分化系數(shù)（G st）為0.2233，說明在總的遺傳變異中有22.33％存在于居群間；基因流（N m）為1.7395，說明居群間的基因交換較多。

3 結論和討論

采用10對SSR引物對8個山荊子居群的基因組總DNA進行PCR擴增，根據(jù)其基因位點多態(tài)性可知：山西中條山居群的遺傳多樣性最高，其Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.3092，Shannon信息指數(shù)（I）為0.4592；山西靈空山居群的遺傳多樣性也較高，H為0.3056，I為0.4532。陳曦等［5］根據(jù)山荊子居群的RAPD分析結果，認為山西靈空山居群的遺傳多樣性最高（H=0.3045，I=0.4526）。雖然2種方法的結果不一致，但從絕對數(shù)值來看，二者差異不大。本研究結果表明：與蘋果屬植物的遺傳多樣性［14］相比，山荊子居群間的遺傳多樣性（H=0.3551，I=0.5285）明顯低于蘋果屬野生種（H=0.86，I=2.07）及蘋果砧木（H=0.76，I=1.63），其原因與居群劃分方法的不同有關；但本研究結果與蘋果屬其他種類，如新疆野蘋果〔Malus sieversii（Ledeb.）Roem.〕［8］、湖北海棠〔M.hupehensis（Pamp.）Rehd.〕［15］、變?nèi)~海棠〔M.toringoides（Rehd.）Hughes〕［16］和小金海棠（M.xiaojinensis Cheng et Jiang）［17］等種類的遺傳多樣性水平相近。

聚類分析結果表明：在Nei’s遺傳距離0.1486處，供試的8個山荊子居群被分成3組，居群間的Nei’s遺傳距離最大值為0.2274，與RAPD標記的聚類分析結果相似（RAPD標記的Nei’s遺傳距離最大值為0.2249）［5］。但是，同一地域內(nèi)小居群間基于SSR和RAPD標記的遺傳關系分析結果并不完全一致，其中山西中條山和管涔山居群以及黑龍江小興安嶺居群的差異較大，推測這些山荊子居群在遺傳上可能具有特定的雜合性和分化方向，也可能與這些居群處于從隨機進化向定向進化的過渡狀態(tài)有關。

基于SSR標記的8個山荊子居群的遺傳組成和基因流大小與其RAPD標記［5］和ISSR分析［18］的結論基本一致，按照Wright［19］的理論，表明山荊子群體相對穩(wěn)定，不存在遺傳漂變，但分化程度較高。聚類結果顯示：地理位置相近的居群并沒有聚在一起，如山西五臺山居群、北京東靈山居群和山西管涔山居群地理位置相近，但僅前二者緊密相聚，山西管涔山居群則與中部的核心居群聚在一起。推測山荊子的遷移擴散可能是從核心居群向外擴展，由于同區(qū)域內(nèi)小居群間基因流不對稱或不均等，加之特定地理居群可能受到強有力的外界選擇壓力，產(chǎn)生了遺傳分化。結合“多樣性中心就是起源中心”的理論推測：山荊子起源于我國的華北和東北地區(qū)，向四周擴散后在基因流不對稱和生境的強有力選擇壓力下形成了現(xiàn)有的多樣性分布格局。

［1］梁國魯，李曉林.中國蘋果屬植物染色體研究［J］.植物分類學報，1993，31（3）：236-251.

［2］余德浚，閻振蘢，張 鵬.中國果樹砧木資源［M］∥中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹所.果樹砧木論文集.西安：陜西科學技術出版社，1985：3-10.

［3］王雷宏，湯庚國.山荊子臘葉標本表型性狀變異分析［J］.西北植物學報，2007，27（8）：1690-1694.

［4］王雷宏，湯庚國，夏海武，等.山荊子葉脈序的研究［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2008，32（2）：39-42.

［5］陳 曦，湯庚國，鄭玉紅，等.蘋果屬山荊子遺傳多樣性的RAPD分析［J］.西北植物學報，2008，28（10）：1954-1959.

［6］ROBINSON JP，HARRIS S A，JUNIPER BE.Taxonomy of the genus Malus Mill.（Rosaceae）with emphasis on the cultivated apple，Malusdomestica Borkh.［J］.Plant Systematic and Evolution，2001，226（1/2）：35-58.

［7］NEIM.The new mutation theory of phenotypic evolution［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104：12235-12242.

［8］ROUZINE IM，RODRIGO A，COFFIN JM.Transition between stochastic evolution and deterministic evolution in the presence of selection：general theory and application to virology［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65（1）：151-185.

［9］DOYLE JJ，DICKSON E E.Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis［J］.Taxon，1987，36（4）：715-722.

［10］LIEBHARD R，GIANFRANCESCHIL，KOLLER B，et al.Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple（Malus×domestica Borkh.）［J］.Molecular Breeding，2002，10（4）：217-241.

［11］GOUL?O L，OLIVEIRA C M.Molecular characterisation of cultivars of apple（Malus×domestica Borkh.）usingmicrosatellite（SSR and ISSR）markers［J］.Euphytica，2001，122（1）：81-89.

［12］BENSON L L，LAMBOY WF，ZIMMERMAN R H.Molecular identification of Malus hupehensis（tea crabapple）accessions using simple sequence repeats［J］.HortScience，2001，36（5）：961-966.

［13］YEH F C，YANG R C，BOYLE T.POPGENE version1.31： Micros of t Window-based Freeware for Population Genetic Analysis［CP/CD］.Edmonton：University of Alberta，1999.

［14］GHARGHANIA，ZAMANIZ，TALAIE A，et al.Genetic identity and relationships of Iranian apple（Malus×domestica Borkh.） cultivars and landraces，wild Malus species and representative old apple cultivars based on simple sequence repeat（SSR）marker analysis［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2009，56（6）：829-842.

［15］康 明，黃宏文.湖北海棠的等位酶變異和遺傳多樣性研究［J］.生物多樣性，2002，10（4）：376-385.

［16］張元元，周志欽.蘋果屬植物變?nèi)~海棠遺傳多樣性形成機理研究進展［J］.果樹學報，2008，25（6）：896-900.

［17］周志欽，成明昊，宋洪元，等.蘋果屬小金海棠的遺傳多樣性初步研究［J］.生物多樣性，2001，9（2）：145-150.

［18］王雷宏，鄭玉紅，湯庚國.8個山荊子居群遺傳多樣性的ISSR分析［J］.西北植物學報，2010，30（7）：1337-1343.

［19］WRIGHT S.Evolution and the Genetics of Populations（Vol.4）： Variability Within and Among Natural Populations［M］.Chicago： University of Chicago Press，1978：4.