盧偉京，李 帥，徐仲杰，盧 浩

(上海化工研究院，上海 200062)

膽甾醇辛酸酯-辛?；?1-13C(簡記為膽甾醇辛酸酯-13C，ChO-13C)是一種13C呼吸試劑，用于診斷脂肪吸收和評價胰腺分泌不足，被認為是有效的診斷試劑，敏感性為68.2%，特異性為75%。[1-4]。

膽甾醇辛酸酯-13C的合成方法未見文獻報道，天然豐度膽甾醇酯合成一般常用酸酐法、酶催化法、酰氯法和縮合法。酸酐法是酸酐和膽固醇反應(yīng)生成膽甾醇酯，具有路線短、條件溫和、收率高等優(yōu)點[5-6]；酶法以假絲酵母脂肪酶合成膽甾醇油酸酯和使用假單胞菌脂肪酶合成膽甾醇22碳六烯酯[7-8]；酰氯法通常是將有機酸轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｂ?，酰氯再與膽固醇反應(yīng)得到相應(yīng)的膽甾醇酯[9-10]，產(chǎn)率為70%～93%[11-12]；縮合法是用縮合試劑促進羧酸和醇的反應(yīng)[13-14]。

酶法的合成效果較好，但酶價格昂貴；酸酐法需要自制辛酸酐-13C，其合成較為繁瑣，收率偏低；酰氯法的產(chǎn)率高，但酰氯過量較多；縮合法具有反應(yīng)條件溫和、合成路線短等優(yōu)點。綜上所述，縮合法較為適宜?？s合法的反應(yīng)機理是羧酸被縮合試劑活化，活化的羧酸再與膽固醇反應(yīng)生成酯。為提高反應(yīng)產(chǎn)率，加酯化催化劑可以進一步活化羧基，促進反應(yīng)進行。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜儀(HPLC)：儀器為日本島津公司產(chǎn)品，配LC-20AT進樣器；蒸發(fā)光檢測器(ELSD)：上海通微公司產(chǎn)品；色譜柱(Shim-Pack, HRC-SIL 4.6 mm×25 cm)：日本島津公司產(chǎn)品；TSQ Quantum Access液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)：美國Thermo Electron公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur3.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)：美國惠普公司產(chǎn)品，配有可變波長紫外檢測器和N2000色譜工作站(浙江大學(xué))；WZZ-2B型自動旋光儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Vance DSX-500核磁共振波譜儀(1H NMR)：德國Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

膽固醇(Ch-OH)：分析純，上海晶純試劑有限公司產(chǎn)品；辛酸-1-13C：自制，13C同位素豐度為98.6 %13C，化學(xué)純度為98.0%[18]；N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、叔胺、N,N’-二異丙基碳二酰亞胺(DIC)：分析純，上海共價化學(xué)科技有限公司；辛酸、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；石油醚：分析純，江蘇強盛化工有限公司產(chǎn)品；膽甾醇辛酸酯13C標(biāo)準(zhǔn)樣品：

2 實驗方法

2.1 膽甾醇辛酸酯-13C的合成

縮合劑法合成膽甾醇酯-辛?；?1-13C(ChO-13C)的反應(yīng)式示于圖1，在縮合劑的作用下，膽固醇(Ch-OH)與辛酸-1-13C反應(yīng)，生成ChO-13C。

在兩口燒瓶中加入膽固醇、辛酸、縮合劑，通氮氣保護，攪拌一段時間，反應(yīng)過程中采用TLC監(jiān)測，產(chǎn)物使用硅膠柱分離提純，TLC檢測收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液，得到白色固體產(chǎn)品。

圖1 縮合催化法合成膽甾醇酯-辛?；?1-13CFig.1 Synthesis of cholesteryl octanoate-octanoyl-1-13C by a method of coupling-catalysis

2.2 膽甾醇辛酸酯-13C的表征

對合成的膽甾醇辛酸酯-13C產(chǎn)品進行HPLC-ELSD分析，分析條件為：流動相為V(正己烷)∶V(異丙醇)=99∶1，流速0.8 mL，柱壓3.5 MPa；ELSD檢測器，蒸發(fā)溫度60 ℃，載氣為空氣，載氣速度2.5 L/min。

采用LC-MS對合成的膽甾醇辛酸酯-13C進行結(jié)構(gòu)和13C豐度測試，分析條件為：電噴霧電離方式(Electrospray Ionization, ESI)，噴霧電壓5 000 V，鞘氣296 475 Pa，輔助氣0 Pa，離子傳輸毛細管溫度330 ℃，正離子Q1模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍是m/z=35～800。

使用旋光儀對合成產(chǎn)品進行光學(xué)純度測試，分析條件：三氯甲烷溶劑，C=2.0，24 ℃，樣品的光學(xué)純度P由下式計算

P=[α]樣品24/[α]標(biāo)樣24×100%

其中 [α]樣品24和[α]標(biāo)樣24分別表示在24 ℃時樣品和標(biāo)樣的比旋光度

采用1H NMR對合成的ChO-13C進行結(jié)構(gòu)分析，檢測條件：500 Hz，CDCl3溶劑。

3 結(jié)果與討論

3.1 DCC為縮合劑的合成實驗

3.1.1辛酸用量對反應(yīng)的影響

辛酸用量對反應(yīng)的影響列于表1。以DCC為縮合劑，叔胺為酯化催化劑，產(chǎn)物經(jīng)HPLC和LC-MS分析為目標(biāo)化合物，表明該方法可行。1#產(chǎn)品純度低，過硅膠柱分離時收集到未反應(yīng)的膽固醇，產(chǎn)品的純度和產(chǎn)率都較低，2#和3#的產(chǎn)品純度均為99.9%，但2#的辛酸利用率較3#高。因此，選擇辛酸過程10%的條件。

3.1.2DCC用量對反應(yīng)的影響

DCC用量對ChO合成的影響結(jié)果列于表2。提高DCC用量，以促進反應(yīng)進行，2#反應(yīng)產(chǎn)物中有過量的膽固醇，提高DCC用量為1.5倍和2.5倍，產(chǎn)率基本無變化。

表1 辛酸用量對反應(yīng)的影響

注：反應(yīng)條件為辛酸∶DCC∶叔胺=1∶1∶1(物質(zhì)的量比)；每克膽固醇的二氯甲烷溶劑為31 mL；室溫，TLC確定合成時間約為24 h

表2 DCC用量對合成ChO影響

注：反應(yīng)條件為辛酸∶膽固醇∶叔胺=1.1∶1∶1.1(物質(zhì)的量比)；其余同表1

3.2 DIC為縮合劑的合成實驗

3.2.1DIC用量的影響

DIC用量對合成的影響列于表3。DIC代替DCC進行合成，其用量增加，產(chǎn)率有所提高，DIC與辛酸物質(zhì)的量比值從1.0增加為1.5，產(chǎn)率從81.8%提高至84.3%，較DCC縮合劑的產(chǎn)率略有提高，比值增加至2.5時，產(chǎn)率提高為85.3%，但反應(yīng)時為渾濁液，不利于合成。綜上所述，選擇縮合劑DIC與辛酸的物質(zhì)的量比值為1.5較為適宜。

3.2.2溫度對反應(yīng)的影響

溫度對反應(yīng)的影響列于表4。ChO的合成反應(yīng)通常在室溫進行，溫變化對反應(yīng)的影響差別較小，屬于實驗誤差范圍(相對誤差小于1.4%)?？梢?，溫度對反應(yīng)影響不大，一般為室溫。

表3 DIC用量對合成的影響

注：反應(yīng)條件為縮合劑DIC，其余條件同表2

表4 溫度對反應(yīng)的影響

注：反應(yīng)條件為DIC∶辛酸∶膽固醇=1.5∶1∶1.65(物質(zhì)的量比)，其余條件同表3

3.2.3正交設(shè)計優(yōu)化

考察的試驗因素和水平表列于表5。采用正交設(shè)計進一步優(yōu)化，實驗結(jié)果列于表6。

表5 試驗的因素和水平表

方差分析表列于表7。正交設(shè)計方差分析表明，因素1反應(yīng)的影響顯著，因素2和因素3的影響不顯著。優(yōu)化實驗條件為，因素1為1.5，因素2為24 ，因素3為31 。

對正交實驗結(jié)果進行3次實驗驗證，平均產(chǎn)率為84.1%，相對誤差小于1.1，純度99.5%～100%。

3.3 豐度合成實驗

以自制13C-辛酸為原料，按以上優(yōu)化的條件，合成ChO-13C，產(chǎn)率84.1%，13C豐度為99.0%。

表6 ChO-13C合成試驗設(shè)計方案及結(jié)果L9(34)

表7 方差分析表

3.4 結(jié)構(gòu)分析

3.4.1HPLC分析

ChO-13C的HPLC-ELSD分析結(jié)果示于圖2，產(chǎn)品的保留時間與標(biāo)樣基本一致，分別為42.98 min和43.32 min，可以確定產(chǎn)品為目的產(chǎn)物，由面積比計算，化學(xué)純度為99.5%。

圖2 ChO-13C的HPLC-ELSD分析Fig.2 HPLC-ELSD spectrum of ChO-13C

3.4.2LC-MS分析

ChO-13C產(chǎn)品的LC-MS的分析示于圖3，m/z=536.49為[M+Na]峰(536.49≈513.84+23)，369.35為膽固醇脫羥基的碎片，161.14也是碎片峰；天然豐度產(chǎn)品的準(zhǔn)分子離子峰為535.49，536.49表示產(chǎn)品上了一個13C。可以確定樣品是的膽甾醇辛酸酯-13C。由收集的536.49峰和535.50峰數(shù)據(jù)計算，產(chǎn)品的13C豐度為99.0 %。

圖3 ChO-13C的質(zhì)譜圖Fig.3 ESI-MS spectrum of ChO-13C

3.4.3光學(xué)純度測試

由合成產(chǎn)品和標(biāo)樣的旋光度測試，光學(xué)純度為99.0%。

3.4.4核磁共振分析

在膽甾醇辛酸酯上的氫原子的信號盡管較復(fù)雜，1H NMR 圖譜上的數(shù)據(jù)基本與SDBS數(shù)據(jù)庫[16]給出部分氫原子的歸屬一致。積分為61個氫，結(jié)構(gòu)上是60個氫，在0.6～2.3區(qū)間積分有一定的誤差(相對誤差為1.67%)二者基本一致?？梢姡铣僧a(chǎn)品的1H NMR與膽甾醇辛酸酯的結(jié)構(gòu)吻合，進一步確定是目標(biāo)產(chǎn)物。

4 結(jié) 論

采用縮合法與催化法的組合方式，合成膽甾醇辛酸酯-辛?；?1-13C，單因素優(yōu)化與正交試驗優(yōu)化合成條件，在DIC：叔胺：辛酸：膽固醇=1.65∶1.65∶1.1∶1(物質(zhì)的量比)，每克膽固醇的二氯甲烷溶劑量31 mL，溫度24 ℃，反應(yīng)時間24 h時，產(chǎn)率為84.1%，13C豐度為99.0%，光學(xué)純度為99.0%，化學(xué)純度為99.5%。經(jīng)HPLC-ELSD、LC-MS和1H NMR表征，所合成的產(chǎn)品為膽甾醇辛酸酯-辛?；?1-13C。

參考文獻：

[1] Ventrucci M, Cipolla A, Ubalducc GM, at al.13C labelled cholesteryl octanoate breath test for assessing pancreatic exocrine insufficiency[J]. Gut, 1998, 42: 81-87.

[2] McClean P, Harding M, Coward WA，et al.Bile Salt-Stimulated Lipase and Digestion of Non-Breast Milk Fat[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 1998, 26(1): 39-42.

[3] Lembcke B. Atemtests bei Darmerkrankungen und in der gastroenterologischen Funktionsdiagnostik (Breath tests in intestinal diseases and functional gastrointestinal diagnosis) [J]. Praxis, 1997, 36(1): 25-26.

[4] 孫蘊偉摘譯.13C標(biāo)記的膽固醇酰辛醇呼氣試驗評估胰腺外分泌不足[J].國外醫(yī)學(xué)-消化系疾病分冊，1998，4(1)：249.

Xun Wenwei (Adapted translation).13C labelled cholesteryl octanoate breath test for assessing pancreatic exocrine insufficiency[J]. Inter J Dig Diseases. 1998，4(1): 249(in Chinese).

[5] Shaikh VAE, Maldar NN, Lonikar SV， et al. Th-ermotropic behavior of cholesterol linked polysaccharides[J]. J Appl Polym Sci, 1998, 70(1): 195-201.

[6] 武長城，李蘭英，張棟，等，丁二酸單膽甾醇酯的合成研究[J].天津工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005, 24(6): 27-29.

Wu Changcheng, Li Lianying, Zhang Dong, et al. Research on synthesis of monocholesterylsuccinate[J]. J Tianjin Polytech Univ, 2005, 24(6): 27-29(in Chinese).

[7] Jonzo MD, Hiol A,Druet D, et al. Application of Immobilized Lipase from Candida rugosa to Synthesis of Cholesterol Oleate[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1997, 69(4): 463-469.

[8] Shimada YY, Hirota, Baba T, et al, Enzymatic synthesis of steryl esters of polyunsaturated fatty acids[J]. J Am Oil Chem Soc, 1999, 76(6): 713-716.

[9] Lentz BR, Barenholz Y, Thompson TE. A simple method for the synthesis of cholesterol esters in high yield[J]. Chem Phys Lipids, 1975, 15( 2): 216-221.

[10] Ma J, Xuan YN, Huang Y. Synthesis and Characterization of A Novel Cholesteric Liquid Crystalline Containing Carboxyl Group[J]. Chin Chem Lett, 2005, 16(1): 127-130.

[11] Nagvekar DS,Delaviz Y, Prasad A, et al. Synthesis and Properties of Cholesteryl Esters Bearing 32- and 16-Membered Crown Ethers[J]. J Org Chem, 1996, 61(4):1 211-1 218.

[12] 顧樹珍，楊新浩，華曦，等.膽甾醇酯類液晶的合成[J].化學(xué)世界，1990，7：308-311.

Gu Shuzhen, Yang Xinhao, Hua Xi, et al. Preparation of Cholesteryl Ester Liquid Crystals[J]. Chem World, 1990，7: 308-311(in Chinese).

[13] Zhang DW, Huang W, Pan GH, et al. Synthesis and characterization of non-symmetrical liquid crystals containing a cholesteryl ester moiety[J]. Chinese Chemical Letters, 2009, 20(5): 562-565.

[14] Boechzelt H, Karten B, Abuja PM, Synthesis of 9-oxononanoyl cholesterol by ozonization[J]. J Lipid Res, 1998, 39(7): 1 503-1 507.

[15] 侯秀紅，盧偉京，盧浩，等.一種辛酸-1-13C的制備方法，中國200810203350[P]. 2008-12-02.

[16] Spectrol Database for Orgcnic Compounds (SDBS數(shù)據(jù)庫)[DB].SDBS NO為7836.