溫 凱，張君麗，陳寶軍，陳大明，崔海平

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

單克隆抗體的問世極大地促進(jìn)了抗體在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，但單克隆抗體大部分為鼠源性抗體，作為異種蛋白會(huì)誘發(fā)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，目前，臨床上的應(yīng)用只局限于檢測(cè)與診斷，在體內(nèi)治療上的應(yīng)用發(fā)展緩慢。近年來，單克隆抗體的鼠源性問題己通過抗體人源化、噬菌體抗體庫及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等技術(shù)得到解決，本實(shí)驗(yàn)所標(biāo)記抗體為一種特異性靶向CD20的嵌合抗體，命名為TGLA。CD20是人類B淋巴細(xì)胞表面特有的標(biāo)識(shí)，不會(huì)發(fā)生明顯的內(nèi)化和脫落，是治療非霍奇金淋巴瘤理想的靶抗原。嵌合抗體TGLA能特異性的結(jié)合CD20，并可通過CDC 和ADCC作用特異性地殺傷CD20+人B細(xì)胞淋巴瘤Daudi和Raji細(xì)胞；同時(shí)能夠抑制Raji腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[1]。抗CD20單克隆抗體作為一種新的有效抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的治療方案，已應(yīng)用于臨床治療B細(xì)胞淋巴瘤。

188Re標(biāo)記的單克隆抗體已大量用于腫瘤的顯像與治療。Re和Tc同處于周期表第Ⅶ族，具有類似活潑的化學(xué)性質(zhì)，像Tc一樣可以形成許多穩(wěn)定的配合物。188Re通過188W-188Re發(fā)生器生產(chǎn)，簡(jiǎn)便易得，更重要的是，188Re的半衰期為16.9 h，188Re[2]放射出的2.12 MeV (71.4%) 和1.96 MeV (25.8% ) β射線可以用于治療，向腫瘤傳遞較高的輻射劑量，并對(duì)靶向腫瘤細(xì)胞附近的抗原表達(dá)陰性的非靶向腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用，同時(shí)可以利用155 keV (15.0% ) 的γ射線進(jìn)行顯像。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用直接標(biāo)記法[3-7]對(duì)TGLA進(jìn)行188Re標(biāo)記，制備得到188Re-TGLA，對(duì)標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化，研究188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

單克隆抗體TGLA：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；188Re淋洗液：原子高科股份有限公司生產(chǎn)的188W/188Re發(fā)生器制備；葡萄糖酸鈉、SnCl2·2H2O、NaHSO3、抗壞血酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 主要儀器

FT-603井型γ閃爍探測(cè)器、FH463A自動(dòng)定標(biāo)器：北京核儀器廠；BS110S分析天平：德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸鼠：10只，鼠齡3周，體重18～22 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供，腋下種植淋巴癌細(xì)胞株，腫瘤直徑約0.5 cm時(shí)備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 188Re直接標(biāo)記法

2.1.1TGLA的還原

取0.1 mL TGLA的PBS溶液(1 g/L， pH 5.0)，10 μL 0.16 mol/L NaHSO3溶液，NaHSO3與單抗物質(zhì)的量比為 1 500∶1，混合搖勻，室溫下反應(yīng)45 min。

2.1.2TGLA的188Re標(biāo)記

用20 μL抗壞血酸(0.1 mol/L) 保護(hù)單抗還原溶液，然后加入175 μL 0.5 mol/L pH 5.0的葡萄糖酸鈉溶液為緩沖液，并作為抗體標(biāo)記的中間配體，50 μL 25 g/L SnCl2溶液(溶于0.05 mol/L HCl)，最后加入100 μL Na188ReO4淋洗液(約5.6 MBq)，反應(yīng)2.5 h。

2.2 標(biāo)記率的測(cè)定

以生理鹽水體系和V(乙醇)∶V(氨水)∶V(水)=2∶1∶5混合溶液為展開體系，利用兩展開體系的互補(bǔ)性測(cè)定188Re-TGLA標(biāo)記率，其中，在生理鹽水體系中188Re-TGLA及膠體Rf=0，188ReO4-的Rf=0.7。乙醇體系中的膠體Rf=0，而188Re-TGLA及188ReO4-的Rf=0.75。放射性HPLC柱填料為Bio-Sil SEC 250，流動(dòng)相為0.1 mol/L PBS溶液，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 標(biāo)記條件的優(yōu)化

(1)還原時(shí)間和SnCl2用量的選擇

取175 μL 0.5 mol/L pH 5.0的葡萄糖酸鈉溶液作為緩沖液，50 μL 25 g/L SnCl2溶液，加入100 μL 5.6 MBq的Na188ReO4淋洗液進(jìn)行還原反應(yīng)。分別取15、30、45、60 min時(shí)的反應(yīng)液，以Whatman試紙為固定相，以生理鹽水作為展開劑檢測(cè)Na188ReO4還原率。測(cè)定還原時(shí)間對(duì)Na188ReO4還原率的影響。保持以上條件不變，分別取10、30、50、70、90 μL 25 g/L SnCl2溶液，還原反應(yīng)45 min，測(cè)定SnCl2用量對(duì)188Re-TGLA標(biāo)記率的影響。

(2)pH、中間配體和標(biāo)記時(shí)間的選擇

分別選用三種不同的中間配體：檸檬酸和酒石酸1∶5的混合溶液、檸檬酸、葡萄糖酸鈉，在最佳標(biāo)記條件下分別進(jìn)行標(biāo)記物的合成，測(cè)定Na188ReO4還原率與188Re-TGLA標(biāo)記率。

保持其他反應(yīng)條件不變，當(dāng)反應(yīng)pH為5.0時(shí)，分別考察標(biāo)記時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)188Re-TGLA標(biāo)記率；反應(yīng)時(shí)間為2.5 h時(shí)，改變葡萄糖酸鈉的pH，分別考察pH為4.0、4.5、5.0時(shí)188Re-TGLA標(biāo)記率。

2.4 體外穩(wěn)定性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用PBS法進(jìn)行188Re-TGLA穩(wěn)定性的測(cè)定，取150 μL含188Re-TGLA的試劑約5.6 MBq，置于1 mL pH 5.0磷酸緩沖液中，恒溫37 ℃下，分別孵育1、2、4、8、24 h后，紙層析法測(cè)定其放化純度，以觀察其體外穩(wěn)定性。

2.5 荷瘤裸鼠體內(nèi)分布

將制備的188Re-TGLA用凝膠柱純化后備用。取正常小鼠10只，隨機(jī)分成2組，每組5只，分別經(jīng)尾靜脈注射10 μL約7.4×105Bq 的188Re-TGLA生理鹽水溶液，分別于注射后24 h、48 h時(shí)處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、骨頭、血、腫瘤等組織稱重并測(cè)量計(jì)數(shù)。經(jīng)衰變校正后計(jì)算各組織放射性攝取率(%ID/g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 188Re-TGLA標(biāo)記率

188Re-TGLA的HPLC結(jié)果示于圖1，由圖1可見，188Re-TGLA保留時(shí)間為9.14 min，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為11.39 min，188Re-TGLA標(biāo)記率為93%。

圖1 188Re-TGLA的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatography of 188Re-TGLA

3.2 標(biāo)記條件的選擇

3.2.1還原時(shí)間對(duì)還原率的影響

還原時(shí)間對(duì)Na188ReO4還原率的影響結(jié)果示于圖2。還原反應(yīng)進(jìn)行到45 min前，還原率逐漸升高，反應(yīng)至45 min時(shí)達(dá)最大值87%，反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，還原率略有下降。這是由于反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，還原后的Re和Sn形成了Re-Sn膠體，影響了反應(yīng)的進(jìn)度，不利于反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，影響最終的標(biāo)記率，因此，最佳的還原時(shí)間選定為45 min。

圖2 還原時(shí)間對(duì)Na188ReO4還原率的影響Fig.2 Effect of reduction time on reduction rate

3.2.2SnCl2用量對(duì)Na188ReO4還原率的影響

由圖3可見，隨著SnCl2用量的增加，還原率不斷上升，用量為1.25 μg時(shí)最高，之后隨著SnCl2用量的不斷增加，還原率略有下降，這是由于過量的Sn與Re生成膠體，使還原率降低。確定SnCl2用量為1.25 μg。

圖3 SnCl2用量對(duì)Na188ReO4還原率的影響Fig.3 Effect of SnCl2 mass on reduction rate

3.2.3中間配體的選擇

中間配體可與188Re 保持弱的絡(luò)合作用，以使188Re處于穩(wěn)定低價(jià)態(tài)，保證后續(xù)配位交換反應(yīng)得以順利進(jìn)行。它又起著穩(wěn)定Sn2+的作用，減少其水解。這三種中間配體的配合能力不同，與Re的結(jié)合能力不同。其中，檸檬酸和酒石酸都是結(jié)合能力強(qiáng)的配體，葡萄糖酸鈉配位能力較弱，使Re順利標(biāo)記到抗體上，與檸檬酸鹽、酒石酸鹽相比，其標(biāo)記實(shí)驗(yàn)條件易掌握、標(biāo)記物穩(wěn)定、放化純度高。在標(biāo)記反應(yīng)中加入適量抗壞血酸保護(hù)溶液，穩(wěn)定低價(jià)態(tài)的Re，增加標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性，又可抑制疏基的氧化，提高標(biāo)記率。

不同的配體下，188Re-TGLA的還原率與標(biāo)記率列于表1，由表1可見，檸檬酸與酒石酸的混合配體溶液有一定的還原性，也可以進(jìn)行標(biāo)記，但是標(biāo)記率與還原率都很低；檸檬酸的結(jié)合力很強(qiáng)，還原率高，但無法用于標(biāo)記；葡萄糖酸鈉具有較高的還原率，而且標(biāo)記率高。這可能是由于檸檬酸的結(jié)合能力強(qiáng)，使還原后的Re很難與抗體結(jié)合，而葡萄糖酸鈉的配合能力相對(duì)較弱，可以將還原后的Re標(biāo)記到抗體上。

表1 不同配體進(jìn)行標(biāo)記的還原率與標(biāo)記率

3.2.4標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響

標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響結(jié)果示于圖4。反應(yīng)2 h，標(biāo)記率隨時(shí)間的增長(zhǎng)不斷升高，到2 h標(biāo)記率趨于穩(wěn)定，標(biāo)記率最高達(dá)87%，繼續(xù)反應(yīng)標(biāo)記率略有下降。因此，選擇標(biāo)記時(shí)間為2～2.5 h，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，Re與Sn可能會(huì)產(chǎn)生膠體，影響標(biāo)記率。

圖4 標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.4 Effect of labeling time on labeling yield

3.2.5pH對(duì)標(biāo)記率的影響

由于SnCl2必須存在于酸性溶液中， pH的范圍選定必須在5.5以下，為了保證抗體的活性，避免Re形成膠體，pH必須保持在3.5以上。因此，在實(shí)驗(yàn)中選定了pH 4.0、4.5、5.0三個(gè)點(diǎn)測(cè)定其標(biāo)記率。結(jié)果顯示，pH對(duì)標(biāo)記率的影響不大，為了減少膠體的產(chǎn)生，選擇pH為5.0。

3.3 體外穩(wěn)定性

188Re-TGLA體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖5。由圖5可以看出，在24 h內(nèi)其放化純度保持較好，仍≥85%，基本維持穩(wěn)定。結(jié)果表明，188Re-TGLA的體外穩(wěn)定性較好。

圖5 188Re-TGLA體外穩(wěn)定性Fig.5 188Re-TGLA’s vitro stability

3.4 188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內(nèi)的分布

188Re-TGLA在荷淋巴瘤裸鼠體內(nèi)的分布結(jié)果列于表2。由表2可見，在給藥24 h后，該藥物在腫瘤攝取較高，血液和肝臟和腎臟攝取較高，在脾，肺等器官也有一定的攝取。在48 h后，血液中仍有較強(qiáng)攝取，腫瘤的攝取降低，肝臟仍有一定的攝取，肝清除較慢，其他器官的攝取降低。此數(shù)據(jù)表明，該抗體在腫瘤中有一定的攝取，在肝臟有一定的富集，血液24 h攝取較高，清除較慢，48 h攝取有明顯下降。由于該抗體在血液中的清除速度較慢，生物半衰期較長(zhǎng)，在24 h并未到達(dá)各臟器及腫瘤，導(dǎo)致腫瘤攝取較低，血液中仍有較高攝取。

表2 188Re-TGLA的荷瘤裸鼠體內(nèi)分布

腫瘤與其他器官的放射性攝取比(T/NT)列于表3中，由表3可見，各器官的T/NT隨時(shí)間的增長(zhǎng)均下降，這說明該藥物在腫瘤中最佳的顯像時(shí)間是24 h以內(nèi)，在體內(nèi)清除較慢，而且188Re的半衰期為16.9 h，相對(duì)于抗體的生物半衰期而言，188Re半衰期較短，對(duì)于顯像來說是一個(gè)不利因素；在肝臟中清除較慢，停留時(shí)間較長(zhǎng)，也增加病人所承受的劑量。減少抗體的體內(nèi)半衰期，可以使用單克隆抗體的片段進(jìn)行標(biāo)記，與188Re的半衰期匹配，以達(dá)到更好的顯像效果。

表3 188Re-TGLA在荷瘤裸鼠體內(nèi)的T/NT

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化188Re直接標(biāo)記條件，標(biāo)記率達(dá)93%，荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腫瘤有一定的攝取，肝腎也有較強(qiáng)的攝取，但在血液中清除較慢。這是由于188Re的半衰期較短，相對(duì)TGLA的生物半衰期較長(zhǎng)，單克隆抗體TGLA的血液清除速度較慢，到達(dá)腫瘤的時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致在腫瘤的攝取并未達(dá)到預(yù)期效果，而且在肝臟的清除較慢也增加了患者的劑量。在今后的實(shí)驗(yàn)中可以嘗試采用188Re直接標(biāo)記抗體片段，降低抗體的生物半衰期，匹配188Re的半衰期，以達(dá)到更好的顯像效果。

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