王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州黃巖318026）

水果中有機(jī)酸的分析方法研究進(jìn)展

王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州黃巖318026）

水果中常見的有機(jī)酸有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乙酸、丁二酸和草酸等，是果實(shí)中主要的風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)，可軟化血管，促進(jìn)鈣、鐵元素的吸收，能刺激消化腺的分泌活動(dòng)，有增進(jìn)食欲、幫助消化吸收及止渴解暑的功能，是果品成熟度、儲(chǔ)藏性以及加工性的重要依據(jù)，其種類和含量與果品品質(zhì)有密切關(guān)系，因此研究水果中有機(jī)酸的組成和含量，在果品品質(zhì)鑒定中占有重要地位[1,2]。由于有機(jī)酸種類較多，易溶于水或乙醇，難溶于其它的有機(jī)溶劑。目前，關(guān)于有機(jī)酸的提取和檢測(cè)方法較多，有水提取法[3～4]、衍生化法[5]、滴定法[6～7]、分光光度法[8]、GC[9～10]、HPLC/HPLC-MS[11～14]等，通過對(duì)這些方法的總結(jié)和對(duì)比，可更好的為不同水果中有機(jī)酸的分析方法研究提供參考依據(jù)。

1 樣品前處理方法

1.1 提取方法

有機(jī)酸主要是含有羧基(-COOH)、磺酸(-SO3H)、亞磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等一類的化合物，與水和強(qiáng)極性的溶劑有很好的溶解性，因此，大多數(shù)采用水和醇類提取。劉文靜等[15]稱取一定量的楊梅勻漿基質(zhì)，加入蒸餾水旋渦振蕩2min，超聲提取15min處理；郭根和等[2]在枇杷果肉的勻漿液中加入一定量 0.04moL· L-1KHPO-HPO，pH為

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2.4 的緩沖液，75℃水浴加熱浸提45min，冷卻至室溫，旋渦振蕩2min，超聲提取15min，過濾；龐新安等[3]對(duì)巴旦杏、無花果、沙棗、石榴采用80%乙醇勻漿提取 5min處理，均取得較好的回收率；沈宏等[16]將番茄勻漿，加入適量的蒸餾水，在75℃水浴中提取15min；王瑞琪等[17]在煙草粉末中加入蒸餾水，壓力為10.3Mpa，溫度60℃，靜態(tài)時(shí)間6min，沖洗體積150%，吹掃時(shí)間100 s，靜態(tài)循環(huán) 1次的條件下加速溶劑萃取其中的有機(jī)酸。

1.2 凈化方法

對(duì)于不同的樣品要采取不同的凈化方法。目前使用最多的凈化方法為液液萃取和固相萃取兩種。郭燕等在測(cè)定蘋果中有機(jī)酸的過程中，經(jīng)過蒸餾水超聲提取后，在10000r/min離心15min和過C18固相萃取小柱(先用2mL甲醇活化，再用5mL水洗去甲醇)，取 5mL試液，以10mL/min流速通過預(yù)活化的固相萃取小柱，棄去初始的 2mL濾液，收集后續(xù) 3mL濾液，用0.45 μ m濾膜過濾[4,18]，均有較好的回收率；高蕓等[5]有機(jī)酸衍生化反應(yīng)后通過二氯甲烷液液分配凈化后，采用氣相色譜測(cè)定；藏祥韻等[19]將水果中的有機(jī)酸經(jīng)過乙醇提取后，濾液通過DEAE纖維素交換柱(柱長20cm、內(nèi)徑 1cm裝約15mL的DEAE纖維素)，先用50mL無離子水洗去糖分及其它雜質(zhì)，再用70mL 0.1N Na2SO4溶液洗脫有機(jī)酸。

1.3 衍生化方法

有機(jī)酸難溶于有機(jī)溶劑，具有一定的酸性，為了能夠用于氣相色譜檢測(cè)，需要發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成沸點(diǎn)低，易于氣化的酯化

物質(zhì)，但存在方法比較繁瑣，反應(yīng)過程不充分等問題。曾有報(bào)道，獼猴桃樣品提取液中加入10%H2SO4-CH3OH溶液，低速機(jī)械振蕩30min，放置過夜進(jìn)行衍生化反應(yīng)[5,20]；杜曦等[21]測(cè)定了葡萄酒中的多元有機(jī)酸，樣品于蒸發(fā)皿中，用0.1mol/L的四甲基氫氧化銨中和至pH為8，水浴蒸干，冷至室溫，以N,N-二甲基甲酰胺分次溶解剩余有機(jī)酸鹽，溶液轉(zhuǎn)移入試管中，逐滴加入一定量碘乙烷，緊塞，搖勻，放置30min后在選定實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析。

2 測(cè)定方法

2.1 液相色譜(HPLC))方法

由于有機(jī)酸易溶于水，一般選擇液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。有機(jī)酸大多數(shù)都有紫外吸收，故選用紫外檢測(cè)器，同時(shí)該類化合物在C18柱上面都能取得較好的分離效果，選取不同的流動(dòng)相可以滿足不同的需求。劉文靜[15]等對(duì)楊梅果實(shí)中的10種有機(jī)酸進(jìn)行液相色譜測(cè)定，流動(dòng)相：0.04mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液，pH值2.4；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量10uL；檢測(cè)波長：214nm，得到有效分離；黃桂穎等[22]測(cè)定了荔枝肉中草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸10種有機(jī)酸，采用0.01mol/L（NH4）2HPO4（pH 3.0）溶液作為流動(dòng)相，流速為1.00mL/ min，檢測(cè)波長為213nm；陳向明等在流動(dòng)相為3%甲醇- 0.01mol/L K2HPO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié) pH為2.0，流速為0.5mL/min，進(jìn)檢測(cè)波長為210nm的條件下測(cè)定銀杏果中7種有機(jī)酸的含量，檢出限在 0.001～ 0.067 μg/mL之間；另外一種采用離子排斥色譜法測(cè)定水果中的有機(jī)酸，其為高容量的樹脂，電離組分受排斥不被保留，而弱酸則有一定保留的原理，即分離機(jī)理為離子排斥。郭燕等[4]采用光電二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定蘋果中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等幾種有機(jī)酸，檢測(cè)波長為210nm，流動(dòng)相為0.01mol/L H2SO4溶液，流速為 0.5mL/min，色譜柱為ICPAKTMION Exclusion(WAT010290)，取得較好的分析效果；郭德華等[23]采用離子排斥色譜法同時(shí)測(cè)定果汁中11種有機(jī)酸，流動(dòng)相也為 H2SO4。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS))分析法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)是使用合適的接口技術(shù)將液相色譜和質(zhì)譜儀聯(lián)結(jié)起來的一種大型儀器，不僅檢測(cè)靈敏度高、選擇性好，并且可以定性、定量檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，對(duì)于初級(jí)監(jiān)測(cè)呈陽性反映的樣品進(jìn)行在線確證，優(yōu)勢(shì)十分明顯。

王乃平等采用液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定廣山楂有機(jī)酸含量色譜柱為Kinetex HILIC100 A ( 4.60 mm×100 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量 0.5 μ L，質(zhì)譜條件為ESI離子源，檢測(cè)方式為MRM多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)，負(fù)離子模式，干燥氣溫度35℃，霧化器壓力40Psi，干燥氣流速10L/min，掃描方式選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，結(jié)果顯示，蘋果酸、檸檬酸、酒石酸 3種有機(jī)酸回收率分別為103.07%(RSD 3.85%)，99.51% (RSD 4.12%)，85.03%(RSD 4.39%)。

2.3 氣相色譜（GC）方法

氣相色譜法(GC法)是采用氣體作流動(dòng)相，待測(cè)組分通過色譜柱，利用物質(zhì)在兩相中的反復(fù)分配，最后實(shí)現(xiàn)組分的分離和檢測(cè)，它分析的對(duì)象是氣體以及可揮發(fā)的物質(zhì)。常用的色譜柱有填充柱、毛細(xì)管柱兩大類，檢測(cè)器一般有ECD、FPD、FID、NPD、TCD等。

對(duì)于有機(jī)酸酯化后的衍生物，其中主要集中在FID的檢測(cè)[5,21,24]，高蕓等對(duì)獼猴桃中的有機(jī)酸進(jìn)行衍生化后，采用氣相色譜法測(cè)定，在DB- 5毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度280℃，升溫程序：初始溫度40℃，保持 2min，以8℃/min升至250℃，保持 6min的色譜條件下取得良好的分離和較高的回收率。

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS))分析法

GC-MS聯(lián)用儀分析農(nóng)藥最初是以電子轟擊離子定性，選擇離子檢測(cè)定量開始的，當(dāng)高靈敏度的離子阱質(zhì)譜儀出現(xiàn)以后，GC-CI-MS方法已成為農(nóng)藥殘留分析的常規(guī)手段。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)既發(fā)揮了色譜法的高分離能力，又發(fā)揮了質(zhì)譜法的高鑒別能力，尤其適用于多殘留分析，現(xiàn)已經(jīng)成為一種相對(duì)成熟的檢測(cè)手段。

目前對(duì)于有機(jī)酸的檢測(cè)大多采用EI源[20,25]，如梁茂雨等采用此方法測(cè)定紅提葡萄中有機(jī)酸，樣品經(jīng)過硫酸甲醇酯化后，選取彈性石英毛細(xì)管柱HP-Innowax，程序升溫：初溫 50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃，保持15min。 進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣量1.0 μ L，分流比10∶1，氦氣流速1mL/ min；EI源電子能量70Ev,電子倍增器電壓1600 V，質(zhì)量掃描范圍30AMU～550 AMU，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，可測(cè)得17種有機(jī)酸。

3 結(jié)語

果實(shí)中有機(jī)酸是決定果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素之一。對(duì)有機(jī)酸成分檢測(cè)技術(shù)的不斷更新能夠更好地為有機(jī)酸在水果中的調(diào)控提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，它在果實(shí)自身代謝中參與了光合作用、呼吸作用，以及合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質(zhì)的代謝過程。通過有機(jī)酸成分檢測(cè)方法的分析和評(píng)述，為有機(jī)酸方面的研究提供更好的依據(jù)。

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