岳巧云 邱德義 胡 佳 劉國雄

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東中山 528403；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局）

1 前言

目前國際上對昆蟲種類的鑒定主要是依據(jù)成蟲的形態(tài)學(xué)特征，相近種類昆蟲的幼蟲、蛹、卵等非成蟲態(tài)的蟲體形態(tài)特征差異小，有些特征在不同的發(fā)育時(shí)期不夠穩(wěn)定，根據(jù)非成蟲態(tài)的蟲體形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種類鑒定很難確保其準(zhǔn)確性，并且需要鑒定者具有非常豐富的分類學(xué)知識和經(jīng)驗(yàn)，因此昆蟲的非成蟲蟲態(tài)鑒定一直是一個(gè)技術(shù)難題。在口岸的日常檢疫過程中經(jīng)常會(huì)截獲大量的醫(yī)學(xué)媒介生物，主要以病媒昆蟲為主，這些病媒昆蟲往往以成蟲、幼蟲、蛹、卵等各種蟲態(tài)以及殘缺不全的蟲體出現(xiàn)。如果截獲的是幼蟲、卵、蛹等非成蟲蟲態(tài)，通常需要將其培養(yǎng)成成蟲后再進(jìn)行鑒定，整個(gè)檢疫鑒定過程時(shí)間長達(dá)數(shù)周；而對于肢體殘缺的樣本更是鑒定困難，大大加長了檢測周期。

近代分子生物學(xué)技術(shù)的興起，為古老的昆蟲分類學(xué)科注入了新的活力。在昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域，分子生物學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于系統(tǒng)演化及分類鑒定兩方面。昆蟲系統(tǒng)演化的研究是從分子水平上找出其種間DNA序列的特異性差異，主要目的為探索昆蟲種、屬間的相對親緣關(guān)系，同時(shí)也為昆蟲的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。

DNA條形碼是一種近年興起的新技術(shù)，它的原理是利用DNA上一段標(biāo)準(zhǔn)的基因片段，作為分子靶標(biāo)來進(jìn)行種級水平的物種鑒定。用于條形碼技術(shù)的DNA片段要具備以下兩個(gè)特點(diǎn)：①長度適中并容易獲得；②保守度適中。線粒體COI基因（Cytochrome Oxidae Subunit I, 細(xì)胞色素氧化酶亞基I）在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)高，獲得技術(shù)簡單，而且序列非常保守，在物種內(nèi)不同個(gè)體之間有1-2%的差異，而近緣種間的差異大，非常適合作為DNA 條形碼技術(shù)的分子標(biāo)記。

2 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)種類鑒定與DNA條形碼技術(shù)的比較

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)種類鑒定的局限性

2.1.1 受發(fā)育狀態(tài)的限制

大多數(shù)生物，尤其是昆蟲主要是根據(jù)成蟲的外部形態(tài)，或者雄蟲外生殖器的形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定，卵、幼蟲、蛹等非成蟲蟲態(tài)一般需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)孵化成成蟲后才能鑒定。根據(jù)蟲體發(fā)育的速度不同，需要的時(shí)間長短不一，但一般需要3-4周的時(shí)間，非常費(fèi)時(shí)[1]。

2.1.2 肢體殘缺的種類無法準(zhǔn)確鑒定

肢體殘缺的種類，如果缺失的是主要的鑒別特征，就很容易造成種類鑒定不準(zhǔn)確或者根本無法鑒定。

2.1.3 對專家的依賴性高，難免主觀判斷的影響

物種的形態(tài)鑒定歷來都是專家的經(jīng)驗(yàn)和權(quán)威性起到很大作用，物種的界定往往以細(xì)微的形態(tài)特征為依據(jù)，因此難免存在主觀判斷的影響。

2.1.4 生物種類的多樣性、復(fù)雜性

地球上的生物種類繁多，據(jù)聯(lián)合國環(huán)境署最新報(bào)告（2011年8月23日華盛頓特區(qū)/英國劍橋訊，聯(lián)合國環(huán)境署網(wǎng)頁新聞w w w.unep.org/newscenter/default.aspx?DocumentID=2649&Arti cleID=8838），地球上生物種類約870萬種。其中650萬種陸地生物，220萬種海洋生物；780萬種動(dòng)物，30萬種植物，60萬種真菌。870萬種是一個(gè)估算值，誤差在130萬種左右，因此地球生物總數(shù)在740萬種到1000萬種之間，但目前只有120萬種為已知的種類[2]。如此繁多的種類，任何專家不可能都熟知。

2.1.5 難以區(qū)別近似種

表型可塑性和遺傳可變性導(dǎo)致難以區(qū)別近似種[3,4]。

2.1.6 數(shù)據(jù)共享性差

傳統(tǒng)的形態(tài)分類主要依據(jù)標(biāo)本的外部形態(tài)，因此需要將實(shí)體標(biāo)本在專家間傳閱，才能確定物種，即使在網(wǎng)絡(luò)和通訊發(fā)達(dá)的今天，所謂的遠(yuǎn)程鑒定，一般的專家很難僅根據(jù)圖片進(jìn)行一個(gè)物種的確認(rèn)，大多需要研究實(shí)體標(biāo)本，因此數(shù)據(jù)的共享性不強(qiáng)。

2.2 DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)越性

2.2.1 鑒定物種不再受蟲態(tài)和蟲體不完整的限制

當(dāng)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中積累了足夠的數(shù)據(jù)后，對以后截獲的卵、幼蟲和蛹等非成蟲蟲態(tài)以及肢體殘缺不全的物種，可以根據(jù)其條形碼數(shù)據(jù)直接和數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，即可達(dá)到物種鑒定的目的，無需將其在培養(yǎng)成成蟲再行鑒定，這樣為進(jìn)一步采取相應(yīng)的檢疫措施節(jié)約時(shí)間[5]。

2.2.2 對鑒定者的專業(yè)技術(shù)要求大大降低

培養(yǎng)一個(gè)傳統(tǒng)的分類工作者往往需要數(shù)年的專業(yè)培訓(xùn)，并且由于物種數(shù)量巨大，大多形態(tài)分類工作者僅對某一個(gè)類群，甚至一個(gè)科或者一個(gè)屬的物種能精確鑒定，而對其他類群無法鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA提取和擴(kuò)增技術(shù)日漸成熟和發(fā)達(dá)，測序商品化越來越方便和便宜，分子分類只需工作者接受一定的訓(xùn)練，有簡單的分子生物學(xué)操作技能。

2.2.3 對外來物種的鑒定將更加準(zhǔn)確快速

傳統(tǒng)分類者的知識具有專一性和局限性，雖然能準(zhǔn)確鑒定本國的物種、自己熟悉的類群，但對外來物種的鑒定則比較困難，必須和國外的分類專家交換標(biāo)本、交流意見，需要很長時(shí)間才能達(dá)到鑒定的目的。建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，當(dāng)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)積累到一定程度，這個(gè)問題將得到解決，達(dá)到外來物種快速準(zhǔn)確鑒定的目的。

2.3 DNA條形碼技術(shù)目前存在的問題

2.3.1 有效數(shù)據(jù)缺乏

DNA條形碼技術(shù)的廣泛應(yīng)用目前很大程度上還受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)缺乏的限制，地球上的870萬種生物中被DNA條形碼編碼的僅占很少一部分。截止2013年7月22日，BOLD（生物DNA條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)，www.barcodinglife.org/index.php/Tax Browser_Home）系統(tǒng)中僅有180683種生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)，因此在實(shí)際應(yīng)用中，大量種類不能被直接鑒定。

2.3.2 形態(tài)分類與DNA條形碼數(shù)據(jù)脫節(jié)

由于多種原因的影響，作為DNA條形碼數(shù)據(jù)投到數(shù)據(jù)庫中的序列，有可能不是形態(tài)分類學(xué)家正確命名的物種，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫中一些物種的條形碼數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，給條形碼技術(shù)的實(shí)際運(yùn)用帶來困難，甚至引起混亂和誤會(huì)。

2.3.3 有些數(shù)據(jù)缺乏統(tǒng)一規(guī)定，不具可比性

由于過去缺乏統(tǒng)一規(guī)定，世界各地的科學(xué)家使用的擴(kuò)增引物不統(tǒng)一，因此得到的基因片段不同、長短不一、質(zhì)量差別，不具可比性，實(shí)用性差，達(dá)不到物種比對鑒定的作用。DNA條形碼聯(lián)盟和BOLD系統(tǒng)的建立為解決該問題起到了積極的作用。

3 DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

被稱為“DNA條形碼之父”的加拿大學(xué)者Hebert于2003年首次提出DNA條碼的概念，他和他的同事選取COⅠ基因的一段序列對動(dòng)物中7個(gè)門、8個(gè)目的不同種群進(jìn)行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)除腔腸動(dòng)物Cnidaria外，98%的物種遺傳差異在種內(nèi)為0%-2%，種間平均為11.3%，顯示該基因具有較好的鑒定物種作用。據(jù)此他提出可以用單一的小片段基因來代表物種，作為物種的條形編碼，為全球生物編碼[6]。2003年3月，在美國冷泉港召開了題為“TAXONOMY AND DNA”的會(huì)議，提出對全球所有動(dòng)物物種COI基因進(jìn)行大規(guī)模的測序計(jì)劃；2003年7月，生物DNA條形碼專業(yè)網(wǎng)站（http：//www.barcodinglife.com）開通，為研究人員提供生物條形碼的研究信息；DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的專業(yè)網(wǎng)站barcoding of life data system簡稱BOLD （http://www.boldsystems.org/）的建立，為利用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定提供了一個(gè)先進(jìn)的平臺(tái)，Ratnasingham 2007[7]詳細(xì)介紹了該網(wǎng)站的功能和使用；2004年生命DNA條形碼協(xié)會(huì)（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）的成立，致力于發(fā)展鑒定生物物種的全球標(biāo)準(zhǔn)，為全球的動(dòng)物物種鑒定提供服務(wù)；2005年達(dá)爾文誕辰紀(jì)念日，來自全球46個(gè)國家220位科學(xué)家在倫敦英國自然歷史博物館參加了第一屆全球DNA條形碼會(huì)議，大會(huì)對DNA條形碼的分類概念、實(shí)驗(yàn)技術(shù)細(xì)節(jié)分析以及資料庫建立等議題進(jìn)行了討論。

DNA條形碼理論作為一種新型分類技術(shù)引起了分類學(xué)界的極大興趣和支持，同時(shí)也由于其缺乏可行的標(biāo)準(zhǔn)而受到懷疑與反對。但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和相關(guān)軟件的開發(fā)，DNA序列信息的豐富性以及獨(dú)一無二的可重復(fù)性，DNA條形碼必將成為分類學(xué)家的有用工具，DNA條形碼技術(shù)也將成為生物分類發(fā)展的必然趨勢。目前，DNA條碼技術(shù)主要應(yīng)用于種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析等研究中，然而，不同物種和不同研究需要所選擇的目的基因不同。近幾年，國內(nèi)外對DNA條形碼進(jìn)行了廣泛的研究和應(yīng)用。比如，Hebert等(2004)[8]對北美260種鳥類進(jìn)行了DNA條形碼的序列分析，結(jié)果表明每種鳥都有一個(gè)單獨(dú)的條形碼，不同種之間的變異平均是同種鳥之間變異的19-24倍，而且發(fā)現(xiàn)其中4種鳥分別出現(xiàn)了2種不同的COⅠ基因序列，這證明北美鳥類中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新種；Hajibabaei 等（2005）[9]利用DNA條形碼技術(shù)對熱帶的鱗翅目昆蟲進(jìn)行了重新分類；Ball等（2005）[10]嘗試用分子條形碼鑒別70多種水生蜉蝣；Armstrong等（2005）[11]通過對過去10年間在新西蘭口岸截獲的毒蛾和實(shí)蠅進(jìn)行COI的一段基因研究發(fā)現(xiàn)，一些以前未鑒定出的毒蛾被定到了科級，同時(shí)許多實(shí)蠅的復(fù)合種也被區(qū)分，同時(shí)他們認(rèn)為COI基因?qū)τ诳诎逗οx的鑒定很有效并有較好的應(yīng)用前景。

近幾年，盡管我國不斷有零星應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)關(guān)系進(jìn)化方面的研究工作，但我國DNA條形碼研究起步略晚。近來國家投入資金支持DNA條形碼的研究，中科院等科研機(jī)構(gòu)也和國外合作進(jìn)行此方面的研究；國家自然科學(xué)基金于2010年通過了DNA條形碼重大課題的論證并立項(xiàng)；國家科技部“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目“檢疫性有害生物DNA條形碼檢測數(shù)據(jù)庫建設(shè)及應(yīng)用”已經(jīng)立項(xiàng)，其中包括“醫(yī)學(xué)媒介生物DNA條形碼檢測技術(shù)及示范應(yīng)用”國家科技支撐計(jì)劃課題，致力于全國和輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物種類的DNA條形碼數(shù)據(jù)的獲得并計(jì)劃將該技術(shù)應(yīng)用到日常檢疫的種類鑒定中。

4 應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定的基本流程

4.1 標(biāo)本的獲得和保存

截獲的輸入性或者本底調(diào)查所得醫(yī)學(xué)媒介生物進(jìn)行種類鑒定，確定憑證標(biāo)本，制作標(biāo)本，記錄標(biāo)本的采集、鑒定等信息等并妥善保管憑證標(biāo)本。憑證標(biāo)本作為DNA條形碼數(shù)據(jù)的來源，必須與DNA條形碼數(shù)據(jù)為一一對應(yīng)的關(guān)系，因此憑證標(biāo)本非常重要，一般需要具備以下基本信息：憑證標(biāo)本名稱（可以是確定的準(zhǔn)確名稱也可以是臨時(shí)性名稱）；憑證標(biāo)本的采集信息（如采集人、帶GPS定位信息的采集地點(diǎn)等）；憑證標(biāo)本的鑒定信息（如標(biāo)本鑒定人、保存號和保存地點(diǎn)等）；DNA條形碼序列信息（如至少大于500bp的COI片段及序列、PCR引物序列等）；追蹤檔案（trace files，如測序原始圖譜、根據(jù)序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化等）。對于醫(yī)學(xué)媒介生物還應(yīng)該包括攜帶病原體的主要種類以及與傳染病的關(guān)系等基本信息。

4.2 基因組DNA的獲得

取憑證標(biāo)本身體的一部分組織，例如蠅、蚊、蠊等醫(yī)學(xué)媒介昆蟲取一側(cè)的一條后腿，鼠類等較大型憑證標(biāo)本可以在制作標(biāo)本時(shí)，取一小塊肌肉或者肝臟作為提取基因組DNA的原料（取組織時(shí)，原則上不破壞憑證標(biāo)本的主要形態(tài)鑒定特征），利用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取憑證標(biāo)本的基因組DNA。對于館藏標(biāo)本，由于館藏時(shí)間、館藏條件、館藏方式的不同以及不同身體部位的DNA含量、組織成分的不同，因此需選擇使用合適的試劑盒或者自制方法提取基因組DNA，旨在獲得高純度、高質(zhì)量的模板DNA，以利于后續(xù)的DNA擴(kuò)增。

4.3 PCR擴(kuò)增

節(jié)肢動(dòng)物尤其是昆蟲，獲得DNA條形碼數(shù)據(jù)的第一選擇引物為動(dòng)物DNA條形碼通用引物，正向引物L(fēng)CO1490：GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G；反向引物HCO2198: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA[12]，以基因組DNA為模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，反應(yīng)體系一般為50μL，擴(kuò)增所用的酶為一般商業(yè)Tag酶即可。

4.4 PCR產(chǎn)物的測序

PCR產(chǎn)物純化后，可以克隆也可以將PCR產(chǎn)物直接交由商業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。

4.5 序列的比對和結(jié)果判定

測序所得的序列，除去引物序列后，與BOLD系統(tǒng)、NCBI系統(tǒng)或者其他數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，根據(jù)序列的相似性和遺傳距離判斷物種。但序列分歧達(dá)到什么程度才能明確為兩個(gè)不同的物種，還需要進(jìn)一步探討，但現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)物種的COI序列表現(xiàn)出低的種內(nèi)遺傳差異及相對較高的種間差異。

5 展望

目前，國內(nèi)外均已開展DNA條形碼的研究項(xiàng)目，發(fā)展趨勢是將DNA條形碼與PCR技術(shù)、DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，最終目標(biāo)是建立高通量、快速、低成本、靈敏準(zhǔn)確的成套檢測技術(shù)，通過快速分析一小段DNA分子，可以鑒定出地球上每一個(gè)生物物種。DNA條形碼是常規(guī)分子檢測方法的提煉與升華，它使科研和檢疫檢驗(yàn)工作更加高效率，可使過去只有專家才能掌握的知識變得簡便易行，因而更好地服務(wù)于大眾與社會(huì)[13-16]。但是關(guān)于利用DNA條形碼進(jìn)行種類鑒定也有不同的觀點(diǎn)，如Dasmahapatra 2010[17]指出利用DNA條形碼技術(shù)鑒定的隱性種有些真實(shí)，有些不是，當(dāng)出現(xiàn)矛盾結(jié)果時(shí)，應(yīng)該運(yùn)用其他分子標(biāo)記技術(shù)如AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)前DNA條形碼運(yùn)用最多也最成熟的領(lǐng)域是動(dòng)物鑒定，尤其是節(jié)肢動(dòng)物鑒定，對于植物及細(xì)菌、病毒中選用何種基因片段合適還有待進(jìn)一步研究。在目前情況下DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用，不能完全脫離形態(tài)分類，尤其是在建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的過程中，脫離形態(tài)鑒定的DNA條形碼技術(shù)將成為無根之水，建立正確的DNA條形碼數(shù)據(jù)需要以準(zhǔn)確的形態(tài)種類鑒定為前提。目前正處于豐富DNA條形碼數(shù)據(jù)的時(shí)期，需要投入大量人力、物力、財(cái)力，需要傳統(tǒng)形態(tài)分類工作者和分子進(jìn)化工作者相互協(xié)作，取長補(bǔ)短，為盡快建立這一通用的國際化鑒定平臺(tái)做出各自的貢獻(xiàn)。

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