趙曉麗 周 琦 張 凱 鄧叢良*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 101312）

1 前言

磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）是指含有磁性金屬或金屬氧化物的超細(xì)粉末且具有磁響應(yīng)性的納米級(jí)粒子，具有獨(dú)特的超順磁性能[1]。由于其比表面積大、表面活性中心多、表面反應(yīng)活性高、吸附能力強(qiáng)、催化能力高、毒性低且不易受體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)各種酶降解等特點(diǎn)，在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

磁性納米粒子的種類(lèi)很多，較常用的有金屬合金、氧化鐵、鐵氧體、氧化鉻等，其中氧化鐵（γ-Fe203、Fe304）磁性材料應(yīng)用最多[2]。磁性納米粒子通過(guò)表面共聚和表面改性的方法，能與有機(jī)物或高分子聚合物或無(wú)機(jī)材料相結(jié)合形成核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合粒子，既具有磁性，又具有表面活性基團(tuán)，能進(jìn)一步和細(xì)胞、酶、蛋白質(zhì)、抗體及核酸等多種生物分子偶聯(lián)。在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性粒子能夠很方便地和底液分離，具有操作簡(jiǎn)便和分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。此外，磁性納米粒子具有大的比表面積，為修飾多種高密度分子探針提供了基礎(chǔ)，在細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純化及DNA分離檢測(cè)等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。

2 基于磁分離技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)

磁性分離技術(shù)（Magnetic Separation, MS）是依據(jù)物質(zhì)的磁性差異，在磁場(chǎng)作用力的驅(qū)動(dòng)下，把磁性組分從非磁性組分混合物中分離出來(lái)的一種分離技術(shù)。傳統(tǒng)的磁性分離理論方法已經(jīng)在許多工業(yè)過(guò)程中獲得了應(yīng)用，如冶金工業(yè)中的礦物磁選分離。由于生物體系中的絕大多數(shù)生物分子都無(wú)磁性，為了給欲分離的目標(biāo)生物分子賦予磁性，需要預(yù)先制備一種磁性載體顆粒作為運(yùn)載工具，借助于磁性分離裝置，對(duì)目標(biāo)生物分子進(jìn)行負(fù)載、運(yùn)載和卸載等分離操作，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物分子的磁性分離過(guò)程。

磁性分離技術(shù)因其具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，近年已被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、食品安全快速檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)和植物病毒檢測(cè)的研究中[7-8]。磁分離技術(shù)可以直接應(yīng)用于目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，也可以和現(xiàn)有的其他生物技術(shù)，如分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、熒光檢測(cè)技術(shù)等相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)更為有效簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)[9]。

免疫磁性分離技術(shù)（Immunomagnetic beadbased separation, IMS）是目前應(yīng)用最廣泛的磁分離技術(shù)，它整合了免疫反應(yīng)的高度特異性和磁性分離快速、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。

2.1 磁分離-PCR檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)雖然靈敏度高，但是因?yàn)槠渌褂玫臉颖就腔罹退谰幕旌象w，因此假陽(yáng)性反應(yīng)較高。利用磁分離技術(shù)先分離或富集目標(biāo)生物分子，然后再結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)的指紋基因進(jìn)行檢測(cè)，可以減少培養(yǎng)基質(zhì)的影響，提高檢測(cè)的速度和靈敏度。

2.2 磁分離-ELISA檢測(cè)技術(shù)

普通的ELISA技術(shù)采用的酶標(biāo)板是一個(gè)固相載體，具有固/液相反應(yīng)接觸面積小，聯(lián)接的抗體易脫落，反應(yīng)速度慢且不徹底等缺點(diǎn)。磁分離-ELISA技術(shù)(MS-ELISA)是一種以磁性納米材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)ELISA中的酶標(biāo)板，將ELISA的顯色系統(tǒng)與磁分離技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新型檢測(cè)方法。利用納米材料的高比表面積、易于形成膠體溶液等特性，MS-ELISA法中的抗原-抗體分子接觸面積變大，反應(yīng)較為徹底，此外磁分離使緩沖液的交換操作更為簡(jiǎn)便快速，靈敏度也得到了提高[10-12]。

2.3 磁分離熒光分析檢測(cè)技術(shù)

熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。磁分離熒光分析技術(shù)是一種將磁分離技術(shù)與熒光分析相結(jié)合的技術(shù)，通常先以磁分離選擇目標(biāo)物質(zhì)，再利用熒光物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。

3 磁分離技術(shù)在檢測(cè)中的應(yīng)用

基于磁性納米粒子的磁分離技術(shù)在生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用一直是生物分析化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，利用磁性納米粒子特殊的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子效應(yīng)等可以在生物分子檢測(cè)中明顯地提高分析與檢測(cè)的靈敏度和選擇性，因此在多個(gè)領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 磁分離技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為了分析檢測(cè)或其他應(yīng)用，通常需要將被研究的生物實(shí)體與其所在的環(huán)境分離。應(yīng)用具有生物相容性的磁性納米粒子的磁分離技術(shù)是達(dá)到該要求的一種方法。

癌癥是目前較難醫(yī)治的疾病之一，但大量臨床事實(shí)證明，癌變初期的治愈率相當(dāng)高，因此治療癌癥的關(guān)鍵在于有效地早期診治。目前確診癌癥最有效的手段是病理診斷，但準(zhǔn)確性往往受限于操作醫(yī)生的工作經(jīng)驗(yàn)，早期病變?nèi)菀茁┰\、誤診。將納米分離技術(shù)與生化檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)Π┌Y進(jìn)行早期診斷[13，14]，是及早預(yù)防和診治癌癥的重要方向，為臨床上癌癥的早期、準(zhǔn)確診斷提供了良好的方法和依據(jù)。

納米免疫磁粒子在磁場(chǎng)作用下具有高的特異性、濃縮性和可分離性，可以對(duì)外周血中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集、濃縮與分離，有助于癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。Taubert等[15]已用白細(xì)胞分化抗原（CD）45單抗標(biāo)記免疫磁性微球?qū)⑼鈬械陌准?xì)胞去除，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的富集，隨后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞。Nam等[16]用標(biāo)記有前列腺特異性抗原（PSA）單抗的磁性微球，通過(guò)夾心法與血清中的PSA形成復(fù)合物，在磁場(chǎng)下分離血清中的PSA，然后用PCR或基因芯片技術(shù)檢測(cè)，其靈敏度比常規(guī)的臨床檢測(cè)方法高6個(gè)數(shù)量級(jí)。Nakamura等[17]應(yīng)用包被Ber-EP4的免疫磁粒子富集外周血中單核細(xì)胞，然后用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)食道癌細(xì)胞。目前，該技術(shù)還用于肺癌[18]、胃癌[19]、肝癌[20-21]和鼻咽癌[22]患者外周血中癌細(xì)胞的檢測(cè)。

乙型肝炎是一種傳染性疾病，只有早期診斷才能盡早隔離，從而控制其傳播。張寶亮等[23]通過(guò)化學(xué)鍵連接的方法制備出表面偶聯(lián)乙肝抗體的磁性復(fù)合微球，采用類(lèi)“雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法”對(duì)乙肝抗體的活性及優(yōu)化效果進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)性能檢測(cè)比較，磁分離技術(shù)法檢測(cè)靈敏度高于普通酶聯(lián)免疫法。李成德等[24]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：磁分離技術(shù)在HBV檢測(cè)中的應(yīng)用對(duì)乙型肝炎患者的臨床診斷和療效監(jiān)測(cè)將有十分重要的意義。

另外，Van Helden等[25]將抗體連接的納米磁性微球與高效率、快速的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)相結(jié)合的自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，成功地用于血清中人免疫缺陷病毒1型和2型（HIV-1和HIV-2）抗體檢測(cè)。Constanine等[26]通過(guò)使用磁分離技術(shù)和免疫PCR技術(shù)檢測(cè)HIV病毒的P24蛋白，在每個(gè)反應(yīng)中可以檢測(cè)到10到100個(gè)P24蛋白分子，從而將檢測(cè)靈敏度提高到不到一個(gè)病毒的檢出能力，所有其他的現(xiàn)有方法中都無(wú)法達(dá)到。

3.2 磁分離技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著人們對(duì)食品安全的重視，致病微生物的檢測(cè)技術(shù)也朝著快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保方向迅速發(fā)展[27]。E.Coli O157∶H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌是引起食物中毒的主要致病菌。目前，免疫磁分離技術(shù)已廣泛應(yīng)用于這4種致病菌的檢測(cè)。

Hand ley等[28]使用磁分離技術(shù)與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記ELISA復(fù)合的方式檢測(cè)大腸桿菌E.Coli O157∶H7，達(dá)到了7.6×103個(gè)活細(xì)胞的下限，更把原來(lái)1d甚至數(shù)d的檢測(cè)時(shí)間縮短到了75min。Notzon等[29]用IMS-熒光PCR技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)肉類(lèi)中的沙門(mén)氏菌，12-13 h即可完成檢測(cè)過(guò)程，IMS-熒光PCR在檢測(cè)自然感染肉類(lèi)和人工感染肉類(lèi)上都具有較高的敏感性和特異性。Hudson 等[30]研究表明，將免疫磁分離技術(shù)與PCR結(jié)合，24 h內(nèi)即可檢出火腿中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，檢出低限為11 cfu/g。Alefantis等[31]用特異性多抗包被磁性納米粒子，用熒光染料Alexa fluor 647結(jié)合特異的單抗來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需40-50 min，靈敏度很高（＜ 100 pg），而且采用此方法不需要二抗，適合于微量樣品的檢測(cè)。

另外，免疫磁分離技術(shù)還用于檢測(cè)其他致病菌[32-35]及食品樣品中的病毒[36]。

3.3 磁分離技術(shù)在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用

目前已經(jīng)有報(bào)道將免疫磁分離技術(shù)引入環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，用于對(duì)環(huán)境中自然水體、生活污水、工業(yè)廢水、土壤環(huán)境中部分細(xì)菌、致病原蟲(chóng)、病毒和有毒有機(jī)物的檢測(cè)。

Lee等[37]采用免疫磁粒子檢測(cè)環(huán)境中的大腸桿菌，靈敏度提高到了20 CFV/100 mL，檢測(cè)時(shí)間則由原來(lái)的超過(guò)24h縮短到1h。張凡飛等[38-39]采用PCR法、免疫磁分離法和神奈川現(xiàn)象培養(yǎng)基三者結(jié)合的方法成功的從環(huán)境中分離出了用一般細(xì)菌培養(yǎng)分離方法很難分離到的TDH陽(yáng)性副溶血性弧菌，極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率，也為研究TDH陽(yáng)性副溶血性弧菌在環(huán)境中的分布及預(yù)防由其引起的食物中毒提供了依據(jù)，該方法對(duì)于水和食品中致病微生物的快速分離和檢驗(yàn)也有著重要的應(yīng)用價(jià)值。Islam等[40]采用IMS和PCR檢測(cè)糞便中的志賀菌，該方法簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)所需時(shí)間為7h，在糞便樣品中的檢測(cè)限為10 cfu/g。李鳳儀等[41]用抗志賀氏菌抗體包被醛基磁性微球，濃集水中的志賀氏菌，然后用 PCR 進(jìn)行檢測(cè)，取得了較好的結(jié)果。Hulten等[42]檢測(cè)了秘魯飲用水中幽門(mén)螺旋菌，該研究用抗幽門(mén)螺旋菌IgG包被的免疫磁粒子富集幽門(mén)螺旋菌，結(jié)合PCR擴(kuò)增，得出結(jié)果證明，秘魯某些飲用水中存在幽門(mén)螺旋菌，與先前流行病研究結(jié)果一致。

1996年，美國(guó)環(huán)?？偩珠_(kāi)始將免疫磁性分離機(jī)技術(shù)應(yīng)用于卵囊和孢囊的檢測(cè)過(guò)程，這是目前國(guó)際上最為常用的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[43]。免疫磁性分離用于多種水域中隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，并提供了很高的檢測(cè)率。囊式過(guò)濾器用于免疫磁性分離后成為檢測(cè)環(huán)境樣中的隱孢子蟲(chóng)的最有效的方法[44]。Mahbubani[45]采用免疫磁粒子分離技術(shù)和PCR擴(kuò)增結(jié)合的方法，檢測(cè)環(huán)境水中污染賈第鞭毛蟲(chóng)包囊DNA，研究發(fā)現(xiàn)，免疫磁粒子法分離環(huán)境水及飲用水中賈第鞭毛蟲(chóng)，并結(jié)合PCR擴(kuò)增目的基因，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。

楊萬(wàn)等[46]建立了一種免疫磁珠分離技術(shù)聯(lián)合實(shí)時(shí)定量PCR快速定量檢測(cè)水中輪狀病毒的方法，通過(guò)制備能夠分離水中輪狀病毒的特異免疫磁珠，優(yōu)化分離條件，建立了免疫磁珠分離前處理方法，并與逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合，成功用于水中輪狀病毒的檢測(cè)。

胡寅等[47]通過(guò)將通用抗體固化在自行制備的納米磁珠表面，建立了有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留納米磁珠間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。與傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)相比，納米磁珠免疫檢測(cè)方法對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有顯著的識(shí)別作用，方法靈敏度大大提高。

3.4 磁分離技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

植物病毒病害是一類(lèi)重要植物病害，幾乎在各類(lèi)作物上都有發(fā)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來(lái)，病毒病在世界各國(guó)的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的種類(lèi)也日益增多。在重要植物檢疫性病毒檢測(cè)技術(shù)方面，我國(guó)出入境植物檢疫采用的手段主要包括口岸現(xiàn)場(chǎng)檢疫、生長(zhǎng)季隔離檢疫、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)鑒定、指示植物鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等。當(dāng)前已經(jīng)有不少關(guān)于采用非特異性磁性納米粒子和RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR相結(jié)合技術(shù)檢測(cè)植物病毒的研究。

闞春月[48]等以黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGM M V）作為研究對(duì)象，將磁性微珠與CGMMV抗血清混合后，制備成包被CGMMV抗體的免疫磁珠分離植物病毒，提取病毒核酸。鄧叢良等以CGMMV[49]、南芥菜花葉病毒（ArMV）[50]、南瓜花葉病毒（Sq M V）[51]、李痘病毒（PPV）[52]等為研究對(duì)象，將磁分離技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，首先利用經(jīng)表面修飾特殊基團(tuán)且不包被抗體的非特異性磁性納米粒子隨機(jī)吸附植物樣品中的病毒粒子，然后用RT-PCR或者Realtime-RT-PCR方法檢測(cè)病毒粒子，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1-2h，檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)Trizol方法提取病毒RNA提高了近10-100倍，減少了有毒有害物質(zhì)的使用和勞動(dòng)力的投入，有效去除了PCR反應(yīng)抑制劑；與免疫磁分離方法相比省去了抗體的使用，降低了成本，提高了檢測(cè)效率，非常適合口岸一線對(duì)植物病毒的檢測(cè)要求。

4 總結(jié)與展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多學(xué)科交叉的新型檢測(cè)技術(shù)也將越來(lái)越多。納米技術(shù)作為一門(mén)新興學(xué)科被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，必將推動(dòng)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展。與現(xiàn)有技術(shù)相比，基于納米磁性粒子的各種檢測(cè)技術(shù)將極大提高檢測(cè)方法的特異性、靈敏度和速度等性能。到目前為止，基于納米磁性粒子的檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境等多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域。但是此檢測(cè)技術(shù)還不完善，還有很多需要改進(jìn)和值得研究的地方，比如：檢測(cè)靈敏度的提高、定量檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)、多元檢測(cè)等。相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，通過(guò)磁性納米粒子建立的各種自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)將在檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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