劉慧慧 王孟昭 胡克 徐燕 馬滿姣 鐘巍 趙靜 李龍蕓 王華竹

1 前言

肺癌中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變主要發(fā)生在胞內(nèi)段編碼結(jié)構(gòu)域（外顯子18-21），包括外顯子19的缺失突變（delE746-A750）和外顯子21點突變（L858R）[1,2]，兩者占所有EGFR激酶突變的90%以上，與對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的敏感性有關(guān)；此外，還有外顯子18點突變（G719S）以及外顯子20插入突變，前者屬于EGFR-TKI的敏感突變而后者與EGFR-TKI的耐藥有關(guān)[3]，發(fā)生率均在5%左右。通常情況下，EGFR突變的NSCLC患者對TKI的治療較敏感。EGFR-TKIs通過與ATP或底物競爭性結(jié)合胞外的配體結(jié)合位點，阻斷EGFR分子內(nèi)酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶的活化，抑制EGFR同源或與ERBB3異源二聚體的形成，從而抑制EGFR激活，阻止下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、加速細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移。但是在臨床工作中，許多患者對EGFR-TKI的治療并不敏感，或者是在治療一段時間后產(chǎn)生耐藥。其耐藥機(jī)制主要包括原發(fā)性耐藥與獲得性耐藥。本文將總結(jié)現(xiàn)有對EGFR-TKI耐藥機(jī)制的研究，對其現(xiàn)況及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 原發(fā)性耐藥

原發(fā)性耐藥是指首次使用EGFR-TKI即產(chǎn)生耐藥，約60% NSCLC患者的耐藥為TKI原發(fā)性耐藥。其中，EGFR基因激活突變者有近30%對TKI原發(fā)耐藥。

2.1 KRAS突變 KRAS是EGFR下游的一個重要信號傳導(dǎo)通路，這兩者都與肺癌的發(fā)生和治療密切相關(guān)。突變后的KRAS基因不依賴于上游EGFR的活化而直接激活MAPK信號通路，導(dǎo)致腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等[4]。大約15%-20%的NSCLC患者中存在KRAS突變。KRAS突變與吸煙有關(guān)。Eberhard等[5]的研究中10例非吸煙患者中均未檢測到KRAS突變。同時，有研究[6,7]表明，在肺癌患者中，EGFR基因突變與KRAS基因突變不能共存，有KRAS突變的患者對EGFR-TKI不敏感。一項臨床研究[8]結(jié)果指出，KRAS突變患者對TKI的臨床反應(yīng)率不足3%。這提示KRAS突變可能與EGFR-TKI原發(fā)性耐藥有關(guān)。Pao等[6]研究的60例肺腺癌患者中，38例對TKI耐藥的患者中有9例存在KRAS突變，但無一例存在EGFR突變，17例EGFR突變患者服用TKI均有效，而9例KRAS突變患者服用TKI均無效。這為KRAS突變與TKI的原發(fā)耐藥相關(guān)提供了臨床依據(jù)。BR21研究[9]中接受厄洛替尼治療的KRAS基因突變患者，與安慰劑組相比，生存期明顯縮短，提示KRAS突變可以導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)耐藥，是其治療的反指征。

2.2 EGFR耐藥突變 NSCLC患者中有大約5%具有外顯子20的插入或復(fù)制突變，此突變與外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變不同，它對EGFR-TKI的治療不敏感，與EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關(guān)。此外，有研究[10]發(fā)現(xiàn)在某些有較高肺癌發(fā)生率的家族中，發(fā)生于EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的外顯子20的T790M突變，即790位點的蘇氨酸被蛋氨酸取代，也與EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關(guān)。但這一突變主要在NSCLC患者對TKI的獲得性耐藥中起主導(dǎo)作用（約占50%）。除T790M突變外，EGFR-TKI的原發(fā)耐藥也可能與EGFR的其他二次突變有關(guān)，例如D761Y突變和E709A突變，它們常與EGFR的藥敏突變同時發(fā)生，導(dǎo)致TKI的原發(fā)耐藥。體外研究[11]亦證實EGFR雙突變體與單突變體相比，對EGFR-TKI的敏感性要差。

2.3 PI3K/AKT信號通路的激活 EGFR的藥敏突變導(dǎo)致EGFR-TKI耐藥的原因，可能是存在影響下游信號的基因突變。例如，EGFR突變的細(xì)胞中PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失時，使得PI3K-AKT過度激活，AKT的過度表達(dá)將抵抗凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生對EGFR-TKI的原發(fā)性耐藥。有實驗室研究[12]發(fā)現(xiàn)，PTEN的表達(dá)下調(diào)或缺失也與NSCLC的獲得性耐藥有關(guān)，但尚沒有臨床證據(jù)的支持。同時，研究[13]發(fā)現(xiàn)PIK3CA（PI3K的P110α催化亞單位）突變在有EGFR突變的日本肺癌患者中發(fā)生率為1.3%，而在沒有EGFR突變的肺癌患者發(fā)生率為2.1%。體外研究[14]已經(jīng)證實，一個組成性活化PI3K的點突變E545K能產(chǎn)生EGFR-TKI耐藥。

2.4 胰島素樣生長因子1受體（insulin like growth factor 1 receptor, IGF1）介導(dǎo)的信號通路 IGF1R信號途徑與EGFR信號途徑的交互作用也是造成EGFR突變細(xì)胞耐藥的機(jī)制。例如，對于EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系同時使用厄洛替尼和IGF1R抑制劑時，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生以及細(xì)胞周期停滯，但各自單獨應(yīng)用時，則只能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？赡苁且驗槎蚵逄婺犭m然能持續(xù)下調(diào)EGFR和ERK磷酸化水平，但由IGF1R介導(dǎo)的AKT活化仍然能起抵抗凋亡的作用。此外，Sharma等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變的NSCLC患者使用EGFR-TKI治療后，體內(nèi)出現(xiàn)了敏感與耐藥混合的細(xì)胞亞群，其中耐藥細(xì)胞染色質(zhì)的特殊狀態(tài)是由IGF1R介導(dǎo)的信號途徑和組蛋白脫甲基酶所調(diào)節(jié)的。同時，有研究[16]指出IGF1R介導(dǎo)的信號通路也是造成EGFR-TKI獲得性耐藥的機(jī)制。但是，這一結(jié)論僅得到了體外實驗的證實，尚未有臨床證據(jù)證明其與獲得性耐藥有關(guān)。

2.5 NF-κB信號途徑的激活 Bivona等[17]發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor-κB, NF-κB）信號途徑的激活也會引起NSCLC對厄洛替尼的原發(fā)耐藥。在具有EGFR突變的肺癌模型中，使用基因?qū)W或藥理學(xué)方法對NF-κB信號通路進(jìn)行抑制后可以增加突變腫瘤細(xì)胞對厄洛替尼治療的敏感性。同樣，NF-κB抑制因子IκB的低表達(dá)是使用厄洛替尼治療無T790M突變的NSCLC患者不良預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。這些結(jié)論一致表明NF-κB信號途徑的過度激活可能引起EGFR突變的NSCLC患者對EGFR-TKI的原發(fā)性耐藥。

2.6 EML4-ALK融合基因突變 研究[18]發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK融合基因在動物體內(nèi)外實驗中均有明顯的致瘤活性，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，EML4-ALK融合基因突變主要發(fā)生于年輕、不吸煙的肺腺癌患者中，病理類型一般為腺泡型或?qū)嶓w腺癌伴粘液分泌型，與EGFR、KRAS突變不共存。Shaw等[19]發(fā)現(xiàn)在很少或不吸煙且沒有EGFR突變的NSCLC患者中，有33%的患者可檢測出EML4-ALK融合基因；同時，他們還對53例NSCLC患者進(jìn)行EGFR-TKI藥物治療，其中療效明顯的19例患者均不存在EML4-ALK融合基因，而對EGFR-TKI耐藥的34例患者中有29%可檢測出該融合基因。因此，EML4-ALK融合基因可能是EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的重要機(jī)制。

2.7 BRAF基因突變 BRAF基因是位于EGFR信號通路下游的信號分子，BRAF蛋白介導(dǎo)RAS與MAPK結(jié)合，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡。約2%-3%的NSCLC患者存在BRAF突變，其中最常見的是V600E[20]。有研究[21]表明，BRAF突變主要發(fā)生于肺腺癌患者，與KRAS和EGFR基因突變不共存。隱含BRAF基因V600E的NSCLC患者對MEK抑制劑PD0325901敏感，但對EGFR-TKI耐藥。但由于BRAF在NSCLC中突變率較低，尚需大樣本研究證實此突變是否與EGFR-TKI的原發(fā)性耐藥有關(guān)。

2.8 人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）突變 HER-2蛋白同EGFR一樣，也是表皮生長因子受體HER家族的成員之一，可以與其他HER家族成員形成同源或異源二聚體，并在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。HER-2基因突變常見于年輕不吸煙的亞裔女性，病理類型多為腺癌，與EGFR及KRAS突變不共存。約2%的NSCLC患者存在HER-2基因突變[22]。此突變使得受體持續(xù)激活，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增殖、轉(zhuǎn)移。體外研究[23]已經(jīng)證實HER-2突變的NSCLC細(xì)胞株對EGFR-TKI耐藥。Han等[24]的研究發(fā)現(xiàn)4例HER-2突變的NSCLC患者中無一例對吉非替尼有反應(yīng)，從而為HER-2基因突變可能導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)耐藥提供了臨床依據(jù)。

2.9 c-Met/肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）信號通路 c-Met基因擴(kuò)增和過度表達(dá)參與了NSCLC對EGFR-TKI的原發(fā)性和獲得性耐藥這兩種機(jī)制。對于有EGFR激活突變的NSCLC腺癌細(xì)胞系，c-Met基因擴(kuò)增和過度表達(dá)可使得自分泌信號通過c-Met/HGF袢傳導(dǎo)，導(dǎo)致PI3K/AKT信號途徑傳導(dǎo)恢復(fù)，而不依賴于EGFR或ERBB3的激活，從而產(chǎn)生對EGFR-TKI的原發(fā)性耐藥[25]。同時，c-Met基因擴(kuò)增也是20%NSCLC患者獲得性耐藥的重要機(jī)制[26]。肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte growth factor,HGF）表達(dá)增加也會過度激活MET介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，降低EGFR-TKI對這種信號級聯(lián)反應(yīng)的抑制。與獲得性耐藥作用機(jī)制不同，原發(fā)性耐藥主要是通過GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白1增加MET的HGF活化，而不是ERBB3的作用[27]。

2.10 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）-成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）信號途徑 特異性的FGF及FGFR是NSCLC腫瘤細(xì)胞自分泌信號通路的重要組成部分。Marek[28]和Kuhn[29]等發(fā)現(xiàn)反義RNA、RNA干擾技術(shù)、中和FGF2抗體以及FGFRTKI等可以抑制NSCLC細(xì)胞系的增殖及腫瘤生長。說明FGF和FGFR的共表達(dá)為某些NSCLC細(xì)胞系提供了自分泌生長信號通路。此通路也被證實可以介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥。FGF-FGFR信號通路主要存在于肺鱗癌和大細(xì)胞癌中，使腫瘤細(xì)胞更傾向于向間充質(zhì)狀態(tài)分化[28,30]。這與對EGFRTKI敏感的肺腺癌及支氣管肺泡癌原發(fā)腫瘤或細(xì)胞系的分化狀態(tài)的多樣化明顯不同。Thomson等[30]還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)向FGFR及血小板源性生長因子受體（platelet drived growth factor receptor, PDGFR）介導(dǎo)的信號通路的轉(zhuǎn)變與上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發(fā)生同步。而EMT現(xiàn)象已被研究證實與EGFRTKI耐藥相關(guān)[31]。

2.11 EMT現(xiàn)象 EMT參與了胚胎發(fā)育過程中的器官塑性，是一種重要的自然生理現(xiàn)象。研究[32]發(fā)現(xiàn)，很多上皮來源的腫瘤都存在EMT，如肺癌、乳腺癌等。上皮細(xì)胞在失去上皮特征而重獲間質(zhì)特征以后，在侵襲、抗凋亡及轉(zhuǎn)移能力方面都有很大提高。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGFβ1）、FGF、HGF、PDGF等均可能是EMT的誘導(dǎo)因子。同時，參與誘導(dǎo)EMT的信號通路（如Src、MAPK及PI3K等）均在EGFR-TKI耐藥中發(fā)揮作用。研究認(rèn)為，EGFR-TKI的原發(fā)性耐藥株通常表現(xiàn)為上皮基因表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，即EMT現(xiàn)象。Coldren等[31]也通過研究證實EMT是NSCLC對EGFR-TKI原發(fā)耐藥的機(jī)制之一。同時，EMT也已在實驗室細(xì)胞模型中被證實與EGFR-TKI獲得性耐藥相關(guān)[33,34]。最近，有研究[35]發(fā)現(xiàn)EMT確實存在于獲得性耐藥的EGFR突變的NSCLC患者中。但耐藥腫瘤組織中的間質(zhì)樣細(xì)胞是在TKI治療前即存在，還是在TKI治療過程中誘導(dǎo)發(fā)生尚不明確。

3 獲得性耐藥

雖然在EGFR突變的NSCLC患者中吉非替尼和厄洛替尼可以起到很好的療效，但大部分患者在治療6個月-12個月內(nèi)會發(fā)生獲得性耐藥。目前對EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制的認(rèn)識主要有以下幾個方面。

3.1 EGFR二次點突變 EGFR的二次點突變可能是在EGFRTKI治療過程中產(chǎn)生的，但也有大量證據(jù)支持此突變是在開始TKI治療前即存在，只是通過吉非替尼或厄洛替尼的作用被篩選出了耐藥克隆。T790M突變是NSCLC患者中最常見的EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制，其突變位點在20外顯子，即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被蛋氨酸取代。TKI獲得性耐藥的EGFR突變患者中有50%存在T790M突變[36,37]。其導(dǎo)致耐藥的可能機(jī)制：①790位點的蘇氨酸（T）被一個較大體積的蛋氨酸（M）替代，出現(xiàn)位阻效應(yīng)，減弱了EGFR與ATP口袋中藥物的結(jié)合力。蛋氨酸的一條較大的氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成的空間位阻，阻止了TKI和EGFR酪氨酸激酶催化域中的Mg-ATP位點的結(jié)合，但對ATP和酪氨酸激酶的結(jié)合沒有影響，激酶可以繼續(xù)磷酸化。②T790M突變使EGFR與ATP的親和力增加了至少10倍，恢復(fù)到野生型EGFR水平，ATP可以完全取代EGFRTKI與EGFR結(jié)合。近年來又發(fā)現(xiàn)了3個與獲得性耐藥有關(guān)的EGFR第二位點突變，包括D761Y（外顯子19）、T854A（外顯子21激活環(huán)）[38]和L747S（外顯子19）[39]。這些突變的發(fā)生率較低，三者發(fā)生率總和不到5%。其中，D761位于α-C的螺旋段，突變成酪氨酸后可能會影響鹽橋的形成，且干擾受體的催化區(qū)；T854是與藥物接觸的氨基酸，突變成更小的丙氨酸可能會增加特異性口袋的尺寸，減弱甚至抵消與EGFR-TKI的結(jié)合力；L747位于β3鏈和α-C螺旋結(jié)構(gòu)之間環(huán)區(qū)起始段，是調(diào)控受體活性構(gòu)象平衡的重要氨基酸。

3.2 MET基因擴(kuò)增 MET是HGF的受體，編碼HGF酪氨酸激酶受體的跨膜區(qū)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增有關(guān)。2007年，Engelman等[40]首次提出原癌基因MET的擴(kuò)増是EGFR-TKI的一種耐藥機(jī)制；他們在構(gòu)造吉非替尼耐藥細(xì)胞株模型時發(fā)現(xiàn)這種耐藥是由MET基因擴(kuò)增引起的；有22%的EGFR-TKI耐藥患者的腫瘤組織中存在MET基因擴(kuò)增。MET原癌基因擴(kuò)增存在于20%的TKI獲得性耐藥的NSCLC患者中，其中有近一半的患者同時具有T790M突變。MET擴(kuò)增通過激活ERBB3-PI3K信號途徑來持續(xù)激活下游的信號通路，從而避開EGFR-TKI的靶點-EGFR，導(dǎo)致NSCLC對TKI產(chǎn)生耐藥。MET的配體HGF除了可以導(dǎo)致原發(fā)性耐藥以外，也能引起TKI的獲得性耐藥。Turke等[27]通過檢測并對比27例用藥前后的NSCLC患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)有16例患者在經(jīng)過TKI治療后HGF增多。Guix等[41]研究發(fā)現(xiàn)HGF通過選擇性擴(kuò)增MET基因過表達(dá)的克隆而發(fā)揮對EGFR-TKI的耐藥作用。

3.3 EGFR突變基因丟失或拷貝數(shù)下降 Tabara等[42]研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變基因丟失或拷貝數(shù)下降可能會引起EGFR-TKI的獲得性耐藥。在建立的厄洛替尼耐藥細(xì)胞系中，EGFR激活突變（外顯子19 delE746-A750或外顯子21 L858R）的基因拷貝完全或部分丟失。而野生型EGFR基因拷貝數(shù)沒有變化。因此，推測EGFR突變基因丟失或拷貝數(shù)下降可能會導(dǎo)致TKI的獲得性耐藥。

3.4 NSCLC向小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）的組織學(xué)轉(zhuǎn)變equist等[35]研究報道，在37例EGFR-TKI耐藥的NSCLC腫瘤組織中有5例出現(xiàn)了向SCLC組織學(xué)類型的轉(zhuǎn)變，促使這一轉(zhuǎn)變的分子學(xué)改變尚不清楚，但此組織學(xué)轉(zhuǎn)變在79例未經(jīng)EGFR-TKI治療的NSCLC患者的腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)。

3.5 其他機(jī)制 EGFR T790M突變和MET基因擴(kuò)增是NSCLC患者EGFR-TKI獲得性耐藥的主要機(jī)制，占60%左右。而其他40%獲得性耐藥的原因還在積極探索中。如前所述，PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失、IGF1R介導(dǎo)的信號通路及EMT等可能參與了EGFR-TKI原發(fā)性和獲得性耐藥兩種機(jī)制。其他可能導(dǎo)致獲得性耐藥的機(jī)制尚有：①研究[43]報道m(xù)TOR與EGFR-TKI獲得性耐藥有關(guān)，mTOR通路被阻斷后，腫瘤生長會受到干擾，可能是因為EGFR-TKI對核糖體p70S6激酶的活化不起作用；②ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運蛋白（ATP binding cassette, ABC）的藥泵激活后可將藥物泵到細(xì)胞外。ABCG2蛋白突變后可以把TKI泵到細(xì)胞膜外，從而降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)TKI的藥物濃度，產(chǎn)生耐藥[44]。

4 結(jié)語

EGFR-TKI靶向治療相對于傳統(tǒng)化療具有更大的優(yōu)勢，已成為晚期NSCLC的有效治療手段。從基因?qū)W角度尋找適合靶向治療的患者，能達(dá)到更好的治療效果。然而，原發(fā)和獲得性耐藥現(xiàn)象不可避免地發(fā)生使靶向治療的應(yīng)用產(chǎn)生了瓶頸，增加了臨床上治療肺癌的難度。但是研究者們對EGFR-TKI耐藥機(jī)制的不斷探索，能夠幫助我們找到新的可以預(yù)測藥物療效并指導(dǎo)治療方案的分子學(xué)標(biāo)志物，從而使靶向藥物的治療效果進(jìn)一步提高，并能更好地選擇EGFR-TKI的治療對象。同時，我們還可以嘗試克服EGFR-TKI耐藥的發(fā)生，從而給耐藥患者帶來重獲治療的希望。