（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 750011）

禽流感病毒呈世界性分布，絕大多數(shù)禽流感病毒呈隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀。只有少數(shù)禽流感病毒具有迅速傳播和高致病性的特征。禽流感病毒H5、H7、H9亞型的致病性強(qiáng)，危害極大，現(xiàn)有的熒光PCR檢測方法每次只能檢測禽流感病毒單個亞型，費時費力，檢測成本較高。更重要的是對于一批家禽及其產(chǎn)品，現(xiàn)有的單亞型檢測并不能完全適應(yīng)實際需要，迫切需要開發(fā)多種亞型禽流感病毒的快速檢測方法。

1 實驗材料與方法

1.1 病毒和雞胚

1.1.1 禽流感病毒H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原。

1.1.2 禽流感病毒H5、H7和H9亞型分離毒株，均由深圳出入境檢驗檢疫局實驗室于2004年禽流感暴發(fā)流行期間均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。進(jìn)行了相關(guān)的分離保存操作，其他的病毒都由深圳出入境檢驗檢疫局的實驗室保存。

1.2 一步法

RT-PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，設(shè)備與試劑 ABI7900HT熒光定量PCR儀，核酸蛋白分析儀。病毒RNA抽提試劑盒購自Qiagen公司。

1.3 探針和引物的合成與設(shè)計

1.4 抽提禽流感病毒RNA

1.5 禽流感H5、H7、H9雙重實時熒光RT-PCR的建立

1.6 實時熒光RT-PCR的敏感性試驗

1.7 實時熒光RT-PCR的特異性試驗

1.8 三重實時熒光RT-PCR的干擾性試驗

1.9 禽流感病毒三重實時熒光RT-PCR與HA、HI

1.10 禽流感病毒三重實時熒光RT-PCR的田間試驗

2 實驗結(jié)果

2.1 三重實時熒光RT-PCR敏感性試驗

在三重實時熒光RT-PCR的反應(yīng)體系中，將測定的體外轉(zhuǎn)錄的H5亞型的RNA只加入不同稀釋度的H5模板，作10倍連續(xù)稀釋。試驗證實，三重實時熒光RT-PCR方法對H7和H9的敏感性分別約為1 000拷貝和500個拷貝。

同樣，進(jìn)行H5亞型的三重實時熒光敏感性檢測，結(jié)果證實其檢測的敏感性約為1 000個模板拷貝。

2.2 三重實時熒光RT-PCR的特異性試驗

通過對多種感染雞的病毒或細(xì)菌的檢測，只加入在反應(yīng)體系中，H5型特異性實時擴(kuò)增圖（H7和H9型特異性擴(kuò)增圖略）。結(jié)果證實，該方法特異性強(qiáng)，與其他檢測對象無交叉反應(yīng)。禽流感病毒一個亞型的病毒RNA作為模板，同時，加入針對H5、H7、H9亞型的引物、探針進(jìn)行實時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果只得到相應(yīng)亞型的特異性熒光曲線，證實所設(shè)計的引物探針具有型特異性。

2.3 三重實時熒光RT-PCR的干擾性試驗

將H5、H7、H9亞型不同的模板濃度進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2個亞型模板濃度較高，而另一個亞型模板濃度較低，所建立的方法依然可以同時檢測到各個亞型。三個亞型之間的其他濃度組合結(jié)果同上類似。

2.4 三重實時熒光RT-PCR對比試驗

取89份經(jīng)病毒雞胚運用禽流感病毒H5、H7、H9亞型三重實時熒光RT-PCR進(jìn)行盲檢，進(jìn)行分開檢測的模式進(jìn)一步產(chǎn)生樣品的研究，得出的結(jié)論就是48份為禽流感病毒H9陽性，13份禽流感病毒H5陽性，2份為禽流感病毒H5和H9混合感染，26份為陰性。經(jīng)過相關(guān)的比較，能夠得到結(jié)論就是兩者有著明顯的相似程度，幾乎沒有差別。

2.5 三重實時熒光RT-PCR田間試驗

采集的4 000多份喉腔棉拭子、泄殖腔棉拭子及臨床采樣的樣品進(jìn)行檢測，陽性樣品中，H9亞型的禽流感為12份，均為水禽樣品；H5亞型的禽流感為5份，利用禽流感H5、H7、H9亞型三重實時熒光RT-PCR對臨床結(jié)果檢測到喉腔棉拭子陽性3份、泄殖腔棉拭子陽性12份、疑似病料4份。另有4份為H5和H9亞型的混合感染。檢測的結(jié)果也是幾乎沒有任何差別，所以相關(guān)的方法需要進(jìn)一步確立才能夠投入使用。

3 討論

3.1 單重與多重檢測的比較

PCR技術(shù)作為一種高度靈敏、快速簡便的方法現(xiàn)已經(jīng)應(yīng)用于很多病毒的檢測，效率較高，是對傳統(tǒng)檢測模式的突破，已經(jīng)廣泛應(yīng)用。但單重PCR在成本和檢測時間上存在劣勢，需要更加高端的技術(shù)出臺，需要進(jìn)一步降低成本。多重PCR用于病毒、細(xì)菌、真菌的高通量快速檢測和其他方面的檢測已經(jīng)成為研究熱點，用于多種微生物的檢測及轉(zhuǎn)基因的檢測等。

3.2 建立組合

通過分別進(jìn)行禽流感H5、H7、H9亞型單重實時熒光RT-PCR檢測，確定所設(shè)計的引物和探針擴(kuò)增效率高，有著比較高的靈活性，能夠滿足篩選的需要，可又進(jìn)一步實現(xiàn)相關(guān)的內(nèi)容整合。

3.3 三重實時熒光RT-PCR的干擾性

我們選取的各個病毒的模板量均為單重單檢時效果較好的模板濃度，在建立多重實時熒光RT-PCR方法時，即3個亞型的模板濃度相對差別不大。但是如果有臨床的干擾情況，那么就會出現(xiàn)一定的差距，進(jìn)一步對現(xiàn)實產(chǎn)生了矛盾，將禽流感H5、H7、H9的模板濃度進(jìn)行調(diào)整、組合，進(jìn)一步討論針對模版的濃度整合問題是否有著某種干擾。

4 小結(jié)

必須根據(jù)儀器的檢測通道進(jìn)行多重實時PCR檢測時，來選擇熒光標(biāo)記基團(tuán)，才能達(dá)到避免干擾、并且實現(xiàn)檢測的效率性質(zhì)提高。

[1] 朱文斯，賴平安，黃茜華，等.熒光RT-PCR快速檢測禽流感病毒H5亞型的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2003，5（1）：27-30.

[2] 曹梅，田夫林，莊文忠.禽流感病毒血凝素分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（2）：35-37，61 .

[3] 黃金海，王英珍，丁伯良，等.間接ELISA檢測禽流感抗體方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（4）：111-113.